球毛壳菌(Chaetomium globosum)功能基因克隆及表达研究
摘要：
球毛壳菌(Chaetomium globosum)是一种应用前景广阔的植物病害生物防治菌.不仅能有效地防治多种蔬菜,林木和其它大田作物的病害,还能够降解木质素等难降解化合物,含有多种生产高价值酶类的基因,具有重要研究价值.本研究通过分子生物学技术克隆出球毛壳菌(C. globosum)中涉及生物防治,胁迫应答等方面共17个功能基因,通过生物信息学技术对这些基因进行分析,并对部分重要功能基因进行了表达和功能研究. 利用简并引物PCR与RACE技术相结合的方法克隆了重要生物防治基因—内切几丁质酶基因(chi46)的完整DNA及全长cDNA序列,chi46基因DNA序列长1 466bp,cDNA编码区长度为1 350bp,编码449aa,编码蛋白的分子量为46.2kD,理论等电点为5.38.chi46基因DNA序列由2个外显子与1个内含子组成,外显子长度分别为528bp和822bp,内含子长度为73bp.内含子与外显子的剪接位点符合常规的GT/AG型剪接位点特征.BlastP相似性搜索结果表明chi46与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa,XP_323907)的几丁质酶相似性最高为85%.Signal P预测表明chi46氨基酸序列的N端31个氨基酸为信号肽,说明chi46为分泌型酶. 用生物信息学技术从球毛壳菌EST数据库中获得了生物防治相关C4-甲基甾醇氧化酶(sterol)基因3′及5′端cDNA序列,用PCR方法克隆sterol基因的中间部分获得了全长基因.sterol基因cDNA序列(DQ532123)全长1 268bp,编码306个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白的分子量为35.5kD,理论等电点为6.73.sterol基因DNA序列(DQ532124)全长1 151bp由4个外显子与3个内含子组成.内含子与外显子的剪接位点符合常规GT/AG剪接位点特征.从BlastP相似性搜索结果表明球毛壳菌(C. globosum)的sterol基因与粗糙脉孢菌(N. crassa,EAA33004)的sterol基因相似性最高为80%. 在本实验室获得的球毛壳菌(C. globosum)ESTs序列基础上,利用RACE技术克隆了涉及球毛壳菌(C. globosum)胁迫应答,生物降解相关的小热激蛋白基因(hsp22.4,AY491980),过氧化物膜蛋白基因(pero,AY555771),二烯醇内酯水解酶基因(dlh,AY465528)全长cDNA序列;通过生物信息学技术(电子克隆技术)克隆了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh,AY522719),组蛋白H3(AY669068),60S核糖体蛋白L10a(AY669070)等12条基因全长cDNA序列;同时克隆了hsp22.4,pero,dlh,gapdh基因的DNA序列;克隆获得的这些序列已经全部在GenBank上注册.