病虫害RNAi技术中的外源RNA递送策略
病虫害严重威胁着作物安全生产。气候变化和农业环境变化又不断改变病虫害的发生规律，地毯清洗13825404095加剧病虫害的发生。传统的病虫害防控主要依赖化学农药，但化学农药的长期大量使用，导致了病虫害抗药性、环境污染和非靶标病虫害的暴发等一系列问题。利用现代生物技术寻求绿色、安全、高效的病害虫防控策略成为农业可持续发展的趋势。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在真核生物中由双链RNA诱发的同源信使RNA (messenger RNA, mRNA)降解，从而抑制靶标基因表达的现象[]。近年来，在RNAi基础建立新型病虫害防控策略的研究，得到越来越多的关注。由于RNAi依赖于靶标生物的特异基因序列发挥作用，因此病虫害RNAi技术具有高度的靶标特异性，能有效减小对非目标生物的不良影响[]，具有可持续和生态友好的特征。近十年来，RNAi技术对靶标害虫和病原菌的防控潜力在研究和实践中不断得到证实。
然而在农业生产中，病虫害种类多样，形态、结构各不相同，如何有效地将外源dsRNA递送到靶标致病菌或害虫体内是RNAi技术防治病虫害面临的重要挑战。世界各国的科学家们通过不断尝试和探索，不断提高外源双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)递送的效率，取得了一系列重要的进展。本文对相关研究进行了梳理，简述了影响病虫害dsRNA吸收和RNAi信号传递的因素，对常用的外源RNA递送技术进行了综述，并对RNAi技术应用前景和趋势进行了探论，以期为病虫害RNAi技术的研究提供参考。
1 dsRNA的摄取与体内转运机制细胞可以从环境中吸收dsRNA，同时dsRNA或小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)触发的RNAi信号还可在细胞间传递。根据dsRNA是否在细胞间的传递，真核细胞中RNAi反应分为细胞自主性RNAi和非细胞自主性RNAi两大类[]。在前者中，沉默效应仅限于吸收dsRNA的细胞；而在后者中，沉默信号能传递到其他细胞或组织，在所有能够结合dsRNA的细胞中产生沉默效应[]。
1.1 SID蛋白的作用dsRNA摄入和细胞间传递机制的研究是优化基于RNAi病虫害防控策略的基础[]。目前，系统RNAi缺陷蛋白(systemic RNA interference deficiency, SID)和内吞作用在dsRNA摄入和传递中的作用研究较为深入[]。秀丽隐杆线虫的SID蛋白一共有5个，分别是SID-1至SID-5。研究表明，SID对外源dsRNA的摄入和RNAi信号在组织间的传递起着重要作用[]。SID-1作为dsRNA进入细胞的通道，使dsRNA能够穿过细胞膜进入细胞质；同时参与RNAi信号的胞间传递，在系统RNAi中起作用[-]。SID-2位于肠腔膜上，是外源dsRNA摄取所必需的，但不影响RNAi信号的细胞间传递[]。SID-3是一个保守的酪氨酸激酶，也为dsRNA摄取所必需[]。SID-5是一种内体相关蛋白，可与分泌蛋白Sec-22相互作用，该蛋白属于SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)类膜泡运输蛋白，负责分泌蛋白从内质网到高尔基体的膜泡转运，促进细胞间RNAi信号的传递[]。研究表明，Sec-22参与晚期内体/多泡体和溶酶体的融合[-]。但截至目前，晚期内体和外泌体如何调控系统RNAi沉默信号的传递，尚不够明确。马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata) SID-1的同源蛋白silA和silC在dsRNA摄取和RNAi过程中都有重要作用[]，但在玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera)中，SID类似蛋白并不影响系统RNAi[]。
1.2 内吞作用受体介导的内吞作用是生物体摄取生物大分子的重要途径，其中网格蛋白介导的内吞是最主要的受体介导方式。在赤拟谷盗(Tribolium castaneum)中，沉默与网格蛋白介导的内吞途径相关的基因Arf72A、Rab7、AP50和VhaSFD可以阻断RNAi反应[]。沙漠蝗(Schistocerca gregaria)、桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)、十字甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、飞蝗(Diabrotica virgifera)和东亚飞蝗(Locusta migratoria)等昆虫中也有类似现象，表明内吞途径与dsRNA摄取紧密相关[-]。dsRNA的摄取及细胞内转运是影响RNAi效率的重要因素[]，进一步研究内吞途径和dsRNA与靶基因之间的关系，对于提高对dsRNA摄取机制的认识和建立高效的RNAi体系具有重要意义。
2 影响dsRNA递送的因素 2.1 靶基因与dsRNA长度靶基因的选择是RNAi效率的关键因素。选择靶基因可以通过筛选已知功能的病原菌和害虫生存的关键基因，或者通过分析不同发育阶段的基因转录水平筛选特异表达的基因[-]。多数病原菌和害虫并非模式生物，基因组信息尚不完备，因此利用转录分析筛选靶基因更为适用[-]。dsRNA长度也是dsRNA摄入和RNAi效率的决定因素。在对赤拟谷盗的研究中，发现dsRNA长度对细胞摄入影响较大，dsRNA越长效果越好[]。在马铃薯甲虫中，200 bp以上的dsRNA比60 bp的dsRNA能更有效地抑制其生长和导致死亡[]。对西部玉米根萤叶甲的研究认为，60 bp以上的dsRNA能够有效发挥RNAi效果；此外，含有21 bp的目标匹配序列但总长为240 bp的dsRNA相较于单独的21 bp siRNA更易被西部玉米根萤叶甲中肠细胞摄入，RNAi效果更显著[]。
病原真菌RNAi对dsRNA长度的要求相对宽泛，在已有报道中，dsRNA长度范围在20–1 000 bp左右。通过荧光素标记，研究人员发现21 bp的siRNA和800 bp以上的dsRNA分子都能被灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和禾谷镰刀菌快速吸收[, ]。因此，关于dsRNA的有效长度尚无定论，要根据具体情况选择最适长度。
此外，对白蜡窄吉丁(Agrilus planipennis)的研究发现，多个dsRNA组合对RNAi具有增效作用[]。但也有相反的例子，赤拟谷盗中多个dsRNA靶标导致dsRNA摄入的竞争，反而降低了RNAi的效果[]。
2.2 核酸酶昆虫的唾液、肠道和血淋巴中含有多种核酸酶，可降解dsRNA，影响RNAi效率。研究表明，对dsRNA降解能力的不同是昆虫间RNAi效率差异的重要因素之一[]。例如，通过口服和注射的方式将不同的dsRNA送入豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)体内，发现其唾液分泌物和血淋巴都能降解dsRNA，导致不能产生有效的RNAi反应[]。Ghodke等[]报道，桃蚜(Myzus persicae)的中肠分泌物含有胞外核酸酶，能快速降解dsRNA，因此外源dsRNA无法有效抑制靶基因表达。此外，苜蓿叶象甲(Anthonomus grandis)消化道液中含有3种不同的核酸酶，均能降解核酸，影响RNAi效率[]；沙漠蝗肠道中4种Sg-dsRNA酶的表达水平与RNAi的不敏感性相关[]。
昆虫消化系统酸碱度不同，鳞翅目昆虫较鞘翅目昆虫的消化道碱性高，碱性条件下dsRNA不稳定，鳞翅目昆虫对RNAi敏感性较低，而鞘翅目昆虫对RNAi敏感性较高[]。进一步加强核酸酶的研究，有助于更好地揭示和解决靶标病虫害对RNAi敏感性不高的问题。
2.3 dsRNA结合蛋白dsRNA结合蛋白含有dsRNA结合域，可识别RNA二级结构。研究表明，dsRNA结合蛋白是影响RNAi的重要因素之一。真核生物、细菌和病毒中均发现多种dsRNA结合蛋白，包括dsRNA依赖的蛋白激酶、RNA特异性腺苷脱氨酶、RNA解旋酶A、双链RNA结合蛋白Staufen抗体(double stranded RNA binding protein Staufen homolog, STAU)、TAR RNA结合蛋白(TAR RNA-binding protein, TRBP)、核糖核酸酶Ⅲ、PKR活化蛋白等[]。果蝇STAU是最典型的dsRNA结合蛋白，在昆虫、秀丽隐杆线虫和人类细胞中都有同源物[]。对灰飞虱(Laodelphax striatellus)的研究表明，STAU同源物和TRBP影响RNAi效率[]。马铃薯甲虫STAU (STAU-C)也与RNAi效果相关[]。鳞翅目昆虫中尚未发现STAU-C同源物。目前，有关dsRNA结合蛋白对病虫害RNAi影响的研究还不多，dsRNA结合蛋白和RNAi的关系有待于进一步研究。
3 dsRNA的递送策略dsRNA的高效递送是RNAi防控病虫害技术的关键。目前，病虫害防控相关的dsRNA递送策略大体分两类：转化的递送策略和非转化的递送策略。转化递送包括病毒介导的瞬时转化、核基因转化和叶绿体转基因；非转化递送包括dsRNA局部施用、纳米颗粒辅助递送以及dsRNA/纳米颗粒复合物递送。
3.1 病毒介导的瞬时转化利用病毒载体进行外源dsRNA的瞬时递送，需将靶基因的正义链、反义链或反向重复序列构建入病毒载体，通过转染在宿主作物中产生siRNA，同时病毒不断复制实现dsRNA快速积累。基于病毒载体的RNAi (virus induced gene silencing, VIGS)具有快速、高通量、无需体外转录等多种优点，在靶基因研究、筛选和鉴定中应用较多。研究表明，无论RNA病毒还是DNA病毒，VIGS系统都能有效抑制靶基因的转录。Zhang等[]通过VIGS系统干扰大麦条锈菌(Puccinia glumarum)钙依赖磷酸酶亚基基因PsCNA1和PsCNB1的表达，有效抑制了病原菌的产孢和菌丝扩展。通过烟草脆裂病毒载体将烟草天蛾(Manduca sexta) CYP6B46基因dsRNA导入渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)，烟草天蛾取食后，其肠道中的CYP6B46转录本显著减少[]。利用烟草脆裂病毒载体在烟草中瞬时表达与烟粉虱(Bemisia tabaci)乙酰胆碱酯酶和蜕皮素受体基因同源的dsRNA，烟粉虱取食后发生白化死亡[]。利用烟草花叶病毒在烟草中表达柑橘粉蚧(Pseudococcus citri)几丁质合酶和V-ATP酶的dsRNA，造成靶标害虫繁殖力降低、死亡率增加[]。同样地，用马铃薯X病毒在烟草中表达扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis)甲壳质合酶的dsRNA，导致幼虫畸形和成虫数量减少[]。
3.2 核基因转化通过核基因转化的方式递送dsRNA，即利用靶向病原菌或害虫基因的RNAi载体进行植物转基因。害虫取食或病原菌侵染转基因植物后，生长发育受到影响。Tian等[]通过转基因在棉花中表达棉铃虫HMGR基因的dsRNA，有效抑制了棉铃虫HMGR基因的转录和表达水平，抑制了害虫生长。褐飞虱(Nilaparvata lugens)取食表达其蜕皮激素受体dsRNA的转基因水稻后，后代数量明显减少[]。表达棉铃虫HaAK基因的dsRNA的转基因拟南芥，能够有效抑制棉铃虫的生长并导致幼虫死亡[]。Jahan等[]针对致病疫霉(Phytophthora infestans)的4个致病基因进行马铃薯转基因，发现靶向PiGPB1的转基因植株抗病性明显增强，转基因叶片中可检测到24–25 nt的小RNA分子。
利用RNAi机制与其他抗虫转基因协同作用，可以有效提高虫害防控效果。孟山都公司和陶氏农业科学公司联合发明的SmartStax PRO系统，同时表达Bt蛋白Cry 3Bb1、Cry34Ab1/35Ab1和靶向玉米根萤叶甲Snf7基因的dsRNA，显著增强了转基因玉米对玉米根萤叶甲的抑制效果，增加了Bt蛋白持效性，降低了对玉米根部的危害[]。
3.3 叶绿体转基因叶绿体基因组可产生大量转录本，比核基因组能更稳定地表达外源基因。由于叶绿体内缺少RNAi机制，不能将外源dsRNA切割成siRNA，更有利于dsRNA的积累，因此通过叶绿体递送dsRNA，对于提高RNAi效率更具优势。Zhang等[]将靶向马铃薯甲虫β-actin和SHR的dsRNA分别转化烟草叶绿体，结果显示，表达β-actin dsRNA的转基因烟草对马铃薯甲虫幼虫的致死率为100%，表达SHR dsRNA的植株对幼虫致死率为70%，证明了利用叶绿体表达dsRNA的可行性。通过在烟草叶绿体中表达靶向棉铃虫几丁质合酶、细胞色素p450单加氧酶和V-ATP酶的dsRNA，棉铃虫取食转基因烟草后，体内靶基因的转录水平降到极低，幼虫的体重、生长和化蛹率显著降低[]。Bally等[]将棉铃虫乙酰胆碱酯酶的发夹RNA (hairpin RNA, hpRNA)整合到烟草叶绿体基因组中，实现了对靶基因的有效沉默。上述研究表明了叶绿体转基因在表达RNAi防控病虫害方面的优势。此外，叶绿体母系遗传的特性更能防止外源基因通过花粉逃逸，降低了基因漂移的风险。
3.4 dsRNA的局部递送植物上直接施用的dsRNA能被病菌或害虫摄入并导致相应基因的沉默，因此dsRNA的局部递送也可实现病虫害的防控[]，施用方法包括叶面喷洒、根部浸泡、树干或藤蔓注射等[]。Koch等[]在大麦叶片上喷施可同时靶向禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)麦角甾醇合成3个必需基因(CYP51A、CYP51B及CYP51C)的dsRNA，显著提高了大麦叶片对禾谷镰刀菌的抗性。Gogoi等在番茄叶片上直接施用dsRNA防治蚜虫(Aphidoidea)、粉虱(Aleyrodidae)和螨等半翅目害虫[-]。田间条件下，在柑橘树和葡萄藤表面施用的dsRNA可以从根部进入整株植物，有效地沉默害虫的靶标基因[]。
核苷酸修饰可以提高dsRNA对核酸酶的耐受性，提升RNAi效率，将dsRNA持效性延长到几周甚至几个月[]。San Miguel等[]在靶向马铃薯甲虫actin基因的dsRNA片段上增加非天然核苷酸(noncanonical nucleotide)，增加了dsRNA对核酸酶的抗性，喷施到马铃薯叶面上，在温室条件下，植株对马铃薯甲虫的抑制效果可持续约28 d。研究还发现，喷施在叶片上的dsRNA干燥后，不再会受水冲刷的影响，增加了RNAi稳定性和应用潜力。
体外化学合成的siRNA或dsRNA、细菌或酵母表达的dsRNA以及表达dsRNA的细菌或酵母菌株都可以用于喷洒[-]。因此，研发可喷施的核酸农药，进行病虫害防控，具有较好的应用前景[]。
3.5 纳米颗粒辅助递送近年来，纳米技术的研究促进了RNA递送策略的发展。与传统的dsRNA递送相比，借助纳米颗粒进行dsRNA递送，在提高RNAi效率方面具有优势[]。纳米颗粒包括壳聚糖、脂质体配合物、共轭聚合物和阳离子聚合物等有机复合物；磁性纳米颗粒、量子点和金纳米颗粒等无机复合物[]。壳聚糖或壳聚糖衍生物能有效地包裹核酸，通过离子相互作用形成低毒、可降解和生物相容的纳米聚合物，在体内和体外的害虫RNAi防治实验中都有效[-]。壳聚糖介导的dsRNA对冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)具有良好的RNAi效果，2个靶标基因的干扰率分别是62.8%和33.8%，显著提高了对害虫的致死率[]。支链双亲肽胶囊(branched amphiphilic peptide capsules, BAPC)进入细胞后，能在核周积累且持续存在而不被降解。作为纳米载体，BAPC已用于将CRISPR/Cas9、dsRNA和siRNA递送到特定的组织和器官[]。据报道，用BAPC-dsRNA复合物喂食赤拟谷盗和豌豆蚜，可有效提高RNAi效率，增加害虫死亡率[]。
研究表明，纳米颗粒递送dsRNA可以克服多种dsRNA递送的局限，促进dsRNA转运到靶细胞，防止dsRNA被核酸酶降解，提高dsRNA在肠道中的稳定性，增强肠道细胞对dsRNA的摄取等，极大地提高dsRNA被靶标生物吸收摄取的效率[-]。纳米颗粒辅助递送在控制病虫害方面已显示出较好的潜力，但依然存在多种限制因素，如生理pH条件下稳定性差、无法避免被内体吞噬，以及细胞特异性差、无法高效进入靶细胞等[-]。
3.6 dsRNA/纳米颗粒复合物的修饰对dsRNA/纳米颗粒复合物进行修饰，可以有效提升dsRNA的递送效率[]。三聚磷酸钠等交联剂能提高壳聚糖纳米粒子的稳定性，与单独的壳聚糖相比，壳聚糖与三聚磷酸钠交联产生的纳米聚电解质/dsRNA复合物在dsRNA递送中更加高效[-]。Parsons等[]利用聚-[N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺]-dsRNA复合物在果蝇体内的有效吸附，显著提升了RNAi效率。Christiaens等[]设计了一种含有胍基的纳米聚合物，可耐受分解，能在高pH环境中与dsRNA形成稳定的复合物，有效克服dsRNA的降解。此外，Zheng等[]设计了一种能够穿透蚜虫体壁进入血腔并扩散到各组织中发挥RNAi作用的新型纳米载体/dsRNA复合制剂；Yan等[]研发了dsRNA/纳米载体/去污剂，有效提高了对蚜虫体壁的穿透能力，使dsRNA在4 h内穿透蚜虫体壁，沉默靶基因，蚜虫死亡率高达81.67%。Ma等[]合成了一种亲水性星形纳米聚合物(star polymer, SPc)，可以通过静电力、氢键和范德华力与dsRNA自发结合，并保护dsRNA免受降解，提高dsRNA的稳定性，提升RNAi效果。在此基础上Li等[]研发了苦参碱/SPc/dsRNA纳米复合体，通过局部应用实现了对桃蚜的抑制，提高了桃蚜死亡率，并且在野外的起效时间和持效性均显著提高。Ma等[]建立了大肠杆菌表达系统大规模生产hpRNA，将表达的hpRNA/SPc/去污剂混合制成的RNA制剂，对桃蚜进行喷雾，显示出一定的杀虫活性。Thairu等[]研发了一种纳米乳剂，能穿透蚜虫胸部和腹部的气孔，通过气管进入呼吸系统进而发挥RNAi作用。
上述研究表明，利用纳米颗粒和修饰的纳米颗粒复合物递送dsRNA，能显著提升RNAi的效率和病虫害抑制效果[]，尽管目前仍处于起步阶段，但该策略在病虫害控制中具有广阔的应用前景。
4 结论与展望近年来，RNAi技术的发展极大推动了病虫害生物学和基因功能的研究，同时使利用RNAi技术沉默病原菌和害虫的基因从而防控病虫害成为可能。由于RNAi具有基因序列特异性，基于RNAi的防控策略，能有效减小对非靶标生物和环境的影响[]，具有广阔的发展前景。本团队主要围绕稻瘟病菌、灰霉病菌和镰刀菌等重要的植物病原真菌开展致病机理研究，鉴定了大量参与病菌生长发育和致病过程的关键基因[-]。目前，针对上述基因，我们通过合成siRNA和dsRNA以及创制RNAi转基因水稻等方式，开展RNAi技术防控病害的研究，获得了多个具有开发前景的基因靶点、RNA干扰片段和抗性水稻材料[-]。
作为一种新兴技术，RNAi同样面临着许多挑战，包括dsRNA或RNAi的非靶效应、病虫害的抗RNAi机制、靶基因的有效性和dsRNA递送效率等，都影响着RNAi防控病虫害的研究和发展。由于dsRNA/siRNA不翻译蛋白，无论单独的还是吸附在纳米颗粒表面的dsRNA都会快速降解，不易在环境中长时间积累和持续发挥作用，提高dsRNA/siRNA的环境稳定性是目前急需解决的技术难点之一[]。从目前研究来看，利用纳米粒子复合物递送dsRNA的策略具有出巨大的发展潜力，尤其是对RNAi敏感度低的病虫害，优势更加明显。通过对dsRNA和dsRNA/纳米颗粒复合物的修饰，可进一步提高RNAi效率，在未来RNAi的应用中需重点研究[]。此外，当前对dsRNA产品的安全性仍采用对转基因生物的监管方式，亟待建立新的适用于RNAi递送产品和技术的风险评估体系[]。
相对于作物虫害，目前针对病害的RNAi技术研究发展偏慢。我们研究发现，不同的RNA片段对同一靶基因的干扰效果存在差异，干扰不同的基因对同一病原菌的抑制效果不同，同源基因的RNAi对不同病原菌的抑制效果也各不相同[]。同时，由于病原菌种类多样，致病机制复杂，病原菌对外源RNA摄取能力具有较大差异。因此，病害RNAi技术的研究任务也更加艰巨，需要进一步地探索和研究。
随着环境变化和农业生产模式的变革，农作物病虫害的发生频率逐渐增加，对我国的农业发展造成严重威胁，寻求绿色、安全、高效的病害虫防控技术成为农业发展的必然需求。我们相信，在研究者的不断努力下，RNAi技术将会蓬勃发展，基于RNAi的病虫害防控策略将会不断完善，在减少化学农药使用、降低环境污染和保护生物多样性等方面发挥重要作用。