华中科技&复旦 ：人类粪便移植到无菌小鼠体内后，微生物的持续性变化（国人佳作）
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导读 将人类粪便样本移植到无菌（GF）小鼠体内，将有助于建立肠道微生物群与人类表型之间的因果关系。然而，由于人类和小鼠肠道的内在差异以及两种生物饮食的不同，人们可能无法通过FMT（粪菌移植）在小鼠身上复制人类表型；同样，在小鼠模型中有效的治疗方法可能对人类并不有效。在这项研究中，我们旨在确定人类肠道微生物在移植到GF小鼠体内后，在多个实验设计中展现出的显著和一致的变化（即相对丰度）。我们从四项已发表的研究中收集了16S rDNA-seq数据，并分析了1713对人类-小鼠的肠道微生物群概况。令人惊讶的是，平均而言，我们发现只有47%的人类肠道微生物可以在小鼠的物种水平上重建，其中超过1/3发生了显著变化（被称为“可变类群”）。大多数发生了显著变化的人类肠道微生物在多对人类-小鼠之间以及在实验环境中的变化是一致的。因此，大约1/3的人类样本改变了他们的肠道类型，即在FMT后他们的主导物种发生了显著变化。用控制饮食方式喂养的小鼠的肠型变化率（23.5%）比非控制饮食喂养的小鼠（49.0%）要低，这为菌群恢复提供了可能的解决方案。已有报道证明大多数变异类群与人类疾病有关联，其中一些被认为是致病物种。我们的结果强调了使用小鼠模型复制人类肠道微生物群相关表型的挑战，为使用小鼠进行肠道微生物研究的研究人员提供了有用的信息，并呼吁在FMT之后进行额外的验证。一个名为FMT-DB的在线数据库可在#/上公开获得。论文ID
原名：Consistent Alterations of Human Fecal Microbes after Transplantation into Germ-free Mice
译名：人类粪便移植到无菌小鼠体内后，微生物的持续性变化
期刊：Genomics ，Proteomics & Bioinformatics
IF：7.691
发表时间：2021.6.9
通讯作者：陈卫华，赵兴明
通讯作者单位：华中科技大学生命科学与技术学院，复旦大学类脑智能科学与技术研究院
DOI号：10.1016/j.gpb.2020.06.024
实验设计
前言
近年来，人们已经充分认识到，肠道微生物群的改变与人类健康的许多方面有关，其中许多改变具有致病作用。例如，微生物群可能在宿主免疫系统的诱导、训练和功能方面发挥基础性作用，一些研究显示，肠道微生物与疾病的发生和发展有关。然而，尽管人们在计算和实验技术方面取得了进展，但在肠道微生物群改变和人类表型之间建立因果关系方面仍然困难重重。
将人类粪便样本（新鲜或冷冻）移植到无菌小鼠 (GF) 体内的粪便微生物群移植技术 (FMT) 是为数不多的建立人类表型与肠道微生物群改变之间因果关系的方法之一。这些人源化小鼠可用于在生理和分子水平上复制人类表型，研究各自微生物群对宿主功能障碍或疾病表型的相对贡献，并测试某些物种造成的扰动（通常是通过将实验室培养的物种添加到小鼠体内）对感兴趣的表型的影响。因此，这些人性化的小鼠对于寻找人类疾病的可能干预方法也是极其宝贵的。在过去的几年里，已经有了许多此类方法成功应用的报道。例如，最近的研究表明，长双歧杆菌Bifidobacterium longum、产气柯林斯菌Collinsella aerofaciens和/或粪肠球菌Enterococcus faecium添加到接受来自无反应患者FMT操作后的GF小鼠中，可以大大增加抗程序性死亡配体1（抗PD-L1）治疗的疗效。同样，IgA反应中与年龄相关的差异可以在年轻的GF小鼠中复制，那些接受来自婴儿的FMTs的小鼠可以用来证明遗传因素对肠道微生物群和粘膜反应发育以及IgA反应的影响。
然而，由于小鼠和人类的肠道在遗传、行为、生理和解剖上的差异，将人类粪便中的微生物群落移植到GF小鼠体内的结果只是与供体微生物群部分相似，有利于适应受体物种的系统类型。例如，小鼠的肠绒毛比人类的长，而且小鼠的肠道pH值比人类的低。此外，小鼠盲肠较大，是发酵的重要部位，而人类盲肠相对较小。因此，小鼠和人类的原生肠道微生物有很大的不同。例如，最近的一项研究表明，只有4%的人类和小鼠的肠道微生物有95%的同源性，覆盖率为90%。这些结果与大多数病原体能够感染多个宿主这一事实是一致的，但有些则高度适应于单一宿主。
在意识到人类和小鼠肠道之间的差异及其重要影响后，研究人员采取了一些措施来减少这些差异对FMT的影响，包括使用试验性的方法来选择最合适的模型动物，来研究某些细菌和/或用人类食物喂养小鼠。最近，人们还考虑使用其他模型。许多研究表明，肠道微生物可以（至少部分地）受到饮食的影响。例如，普雷沃特氏菌Prevotella的丰度增加与人类膳食纤维的增加有关。不幸的是，这些结论的提出是需要代价的，需要对移植到小鼠体内的人类粪便样本变化进行系统分析。
为了解决这些问题，我们利用已发表的人-小鼠FMT数据集进行了系统的荟萃分析。我们从四项已发表的研究中收集了1713对人-鼠的16S rDNA-seq数据（表1）。这些数据包含了人（FMT前）和相应的受体小鼠（FMT后）的粪便微生物酶测序信息。我们比较了这些人-鼠对中相同物种/属的相对丰度的变化，并确定了持续变化的物种。这些物种的相对丰度高于0.1%，并在FMT后显示出显著的变化（|Log2中位数FC|>1；FC呈倍数变化）。这些物种在相当大比例的人鼠配对中大量存在。另外，我们还确定了可变物种，即那些在FMT后相对丰度呈明显改变的物种。我们的结果对那些在肠道研究中使用（或计划使用）GF小鼠的研究人员具有参考价值。此外，我们的分析还要求对FMT后感兴趣的物种进行额外的验证。例如，检查在不同表型组中发生显著变化的物种在FMT后是否仍然发生显著变化。到目前为止，这种类型的验证大多被忽略了。
结果
我们从共计1713对人-小鼠的FMT实验中收集数据，并分析了人类供体和相应的GF小鼠受体的粪便样本中的相对微生物丰度。对于每一对人-小鼠，我们计算了FMT前后的相对丰度。我们首先检查了FMT实验后有多少肠道微生物可以在小鼠体内重建。我们将分析限制在两组人-小鼠样本中至少有五个测序reads支持的分类群。如图1所示，平均而言，在FMT后，只有47%的人类肠道微生物可以在小鼠肠道中重建；在属水平上可重建60%。这些数据与之前的一些结果一致，但与其他结果有显著不同。例如，Turnbaugh等人使用64对人-小鼠发现，在小鼠FMT后，50%-90%的人类肠道微生物可以在属水平上重建。然而，这些重建率都是基于较少数量的FMT实验。
2 在对GF小鼠进行FMT后，超过三分之一的重建肠道微生物的相对丰度发生了显著且持续的变化
为了捕获肠道微生物的一致性变化，我们还要求一个物种或属至少存在于5对FMT样本中，并在两种实验条件下，每个样品（FMT之前及之后）的相对丰度最低为0.1%。我们估计，在FMT后，超过1/3的重建肠道微生物在属和种水平上的相对丰度都发生了显著且持续的变化。在属的水平上，我们研究中发现的38.9%（37/95）的属在FMT后有明显的变化（即丰度的中位数变化至少为2倍）（图2）。在物种水平上，38.5%（84/218）的物种在FMT后有显著变化（图S1）。我们将这些发生显著变化的分类组分别称为“可变属”和“可变种”，并将它们合称为 “可变分类群”；反之，我们将其他分类群称为 “稳定分类群”。如图3和图S2所示，可变分类群在不同的实验条件下表现出一致的变化。
图2 变异属的相对丰度在FMT后发生了显著变化。A. 箱形图显示在FMT后相对丰度明显增加的可变属。B. 箱形图显示FMT后相对丰度明显减少的可变属。B. 显示FMT后相对丰度变化显著减少的变异属。Log2 median FC<-1，Log2 median FC（对数中位数FC），Log2-transformed median fold change（Log2对数转换后的中位数的倍数变化）。
我们还检查了FMT后肠型的变化。人类的肠道微生物可以分为三个肠型，每个肠型都有不同的主导物种。我们的结果显示，来自人类和小鼠的混合数据也可以被分为三种肠型。虽然最近人们对肠道类型的概念进行了激烈的争论，但它们仍然是更好地理解复杂生物学问题的有用的方法。从一种肠型到另一种肠型的变化往往表明整个肠道微生物群谱发生了重大改变。我们使用之前描述的方法计算了FMT前后所有粪便样本的肠型（）。所有样本的总体分类见图S3。值得注意的是，我们发现32.2%（551/1713）的人类样本在FMT后肠道类型发生了变化。这些结果与1/3的重建物种和/或属的相对丰度在FMT后发生显著改变的结果一致。如图S4中所示，57.2%的I型样品在FMT后发生肠型改变，其次是II型（31.2%）和III型（24.3%）。
我们接下来研究了导致肠型变化的因素。此前的一项研究表明，饮食对肠道微生物有很大影响。根据小鼠是否控制饮食（即人类食物，详见材料和方法），将人-小鼠配对分为两组后，我们发现，用控制饮食喂养的小鼠的肠型变化率（23.5%）明显低于用非控制饮食喂养的小鼠（49.0%）（图4A-C）。如图4B和C所示，在非控制饮食组中，人类I型、II型和III型样本经FMT转化GF小鼠后，分别约有95.6%、49.2%和26.8%的样本发生肠型改变。在控制饮食组中，这些数字分别下降到33.1%、21.2%和23.2%（图4A），主要是由于各自肠型的主要类群的变化减少（表S1）。这些结果与之前饮食对肠道菌群有显著影响的研究结果一致，并可能为在人源化小鼠中更好地保留人类肠道菌群提供有用的线索。然而，我们发现，控制饮食可能会在物种和属的水平上诱导额外的可变分类群（图S5），表明小鼠肠道微生物群对人类饮食的复杂反应以及控制饮食对受体小鼠的影响力是有限的。
接下来我们确定同一属的物种在FMT后是否有类似的变化趋势。我们在包含多个物种的共计27个属中，发现了四种典型的模式（模式I-IV）。模式I由9个属组成；在该组中，大多数种和相应属通常是“稳定类群” (图5A，图S6A)。模式II也包括五个稳定的属（图5B，图S6B）。然而，这些属包括增加或同时增加和减少的物种，有时也包括稳定的物种；这些属的总体丰度在FMT之后没有改变。在FMT之后没有改变。模式III（图5C，图S6C）和模式IV（图5D，图S6D）分别由5个增加的和8个减少的“可变属”组成；包括的物种是增加/减少的变异种或稳定种。分别占33.33%、18.52%，多种属的比例分别为18.52%和29.63%这些结果表明，人类和小鼠对属有明显的物种偏好。
图5 在同一属水平的种在FMT后可能发生明显的变化。A. 模式Ⅰ；B. 模式Ⅱ; C. 模式Ⅲ；D. 模式Ⅳ
5 大多数变异类群都与人类健康和疾病有关值得注意的是，我们发现，大多数已确定的变量类群都与各种人类疾病有关，并且/或可用于疾病干预和治疗 (表2，表S1)。图6显示了8个选定的可变类群（包括4个属和4个种），它们在人类疾病中得到了相对较好的研究。图S7和S8显示了所有在FMT后出现明显变化的可变属和种。据报道，双歧杆菌Bifidobacterium与肥胖症有关，并能通过产生乙酸盐保护人类免受肠道病原体感染。此外，双歧杆菌Bifidobacterium、嗜粘蛋白-阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila和其他物种已被证明可以促进抗肿瘤免疫并促进抗PD-L1的功效。卵瘤胃球菌Ruminococcus obeum已被证明能够竞争性地抑制和控制霍乱弧菌感染。普雷沃氏菌Prevotella copri可诱导胰岛素抵抗，加重葡萄糖耐受，增加循环支链氨基酸水平。柔嫩梭菌Faecalibacterium prausnitzii对小鼠模型有抗炎作用，部分原因是其分泌的代谢物能够阻止NF κB的激活和IL-8的产生。
这些结果凸显了在肠道微生物群研究中使用小鼠模型的挑战：如果疑似致病物种在FMT后的丰度明显下降，不仅很难在受体小鼠中重现人类的表型（在文献和分子水平上），而且如果干预物种对小鼠的适应性比对人类好得多（如嗜粘蛋白-阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila），也很难将治疗方法转回给人类。
讨论
小鼠已被广泛用于人类疾病研究；到目前为止，从人类到小鼠的FMT是为数不多的可用于建立人类肠道内微生物丰度改变与疾病之间因果关系的实验方法之一。然而，由于小鼠和人类肠道的内在差异，将人类粪便中的粪便微生物群落移植到GF小鼠体内，只能重新建立一部分供体微生物群，其中大部分已经适应了受体物种。尽管人们普遍认识到人类和小鼠之间的差异，并且在小规模的研究中发现了少数不同的物种，但尚未对FMT进入小鼠后人类肠道微生物群的改变进行系统分析。
在本研究中，我们收集和分析了1,713个FMT实验，并确定了移植前后的相对微生物丰度（即人-小鼠配对）。我们关注那些在400多对人-鼠中大量存在的物种，其相对丰度高于0.1%，并且在FMT后显示出明显的变化（|Log2中位数FC|>1）。通过满足这些标准，这些变化更有可能在不同的实验条件下结果是一致的。令人震惊的是，我们发现超过三分之一的人类肠道微生物在FMT后在物种和属的水平上都有明显和持续的变化，包括在肠型分析中的主要分类群。移植到用人类食物喂养的受体小鼠的人类粪便（“控制饮食”组）显示出较低的肠道类型变化的减少，这表明有一种可能的方法来减少这种差异。然而，控制饮食可能会在种和属的水平上诱发额外的可变分类群，表明小鼠肠道微生物群对人类饮食的复杂反应以及控制饮食对受体小鼠的能力有限。将人类粪便移植到用人类食物喂养的受体小鼠身上（即“控制饮食”组）显示出肠型变化降低，这表明有可能采用一种方法来减少这种差异。然而，受控饮食可能在物种和属水平上诱发额外的可变类群，这表明小鼠肠道菌群对人类饮食的复杂反应和受控饮食对受体小鼠的有限能力。
结论
我们的结果强调了在肠道微生物群研究中选择小鼠作为动物模型的挑战，并指出，由于可变类群对小鼠和人类肠道的优先适应，将在小鼠中发现的结果直接转移到人类是困难的。
引人注目的是，大多数可变分类群都与人类疾病有关。因此，我们的结果对那些在肠道微生物群和疾病关联研究中使用（或计划使用）GF小鼠的研究人员具有参考价值。此外，我们的结果还要求在FMT后对感兴趣的物种进行额外的验证。例如，研究人员应该检查在不同人类表型组中显著改变的物种在FMT后是否仍然显著改变。换句话说，来自人类患者和健康对照者的粪便样本都应该移植到GF小鼠中；研究人员不仅应该关注感兴趣的表型是否在小鼠中复制，而且还应该关注GF小鼠接受患者和健康粪便的差异丰富的分类群是否与在人类样本中发现的相同。到目前为止，这种类型的验证大多被忽视。