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镰刀菌(Fusarium) 是一类世界性分布的真菌，家电清洗13825404095镰刀菌所产生的次级代谢产物镰刀菌素常侵害玉米等谷类作物、谷类食品和饲料进而影响人类和动物的健康，甚至导致农作物减产，直接对农业经济产生巨大影响[]。有报道称，侵入玉米丝中的真菌病原体包含禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌和黄曲霉及其真菌毒素[]，甚至在残根中还可以发现导致玉米茎腐病、穗腐病的轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides) (Fusarium moniliforme)，被轮状镰刀菌产生的伏马菌素污染的饲料将导致马出现白质脑瘤，猪出现肺水肿和肝综合征，还与大鼠体内的致癌活性物及人类神经管的缺陷有关，从而导致伏马菌素成为动物和人类的致癌物质[]。除此之外，其他真菌对人体也会造成严重的健康影响，拟青霉属(Paecilomyces) 是一种罕见的病原真菌，它在免疫功能低下的人群甚至免疫功能正常的宿主中均会产生严重感染，而变异拟青霉在空气和食物中很常见，与多种人类感染相关，例如真菌血症、心内膜炎、腹膜炎和骨髓炎[]。

蛋白水解酶的催化功能是水解蛋白质的肽键。蛋白水解酶可以攻击植物病原真菌细胞壁，导致细胞溶解和随后的死亡[]。到目前为止，已经对微生物拮抗剂中的几丁质酶和葡聚糖酶进行了研究。然而，关于微生物蛋白酶的信息非常有限。蛋白水解酶根据其催化活性位点的性质和作用条件分为4大类，包括天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶[]。蛋白水解酶与特定基团的结合取决于催化位点的结构和对其活性至关重要的氨基酸，因此，蛋白酶水解各种肽键的能力不同。很多研究发现，丝氨酸蛋白酶具有抗真菌能力，Zhang等从出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌中发现对于核果链核盘菌(Monilinia laxa)、灰霉菌(Botrytis cinerea) 及扩展青霉(Penicillium expansum) 真菌具有抑菌能力的丝氨酸蛋白酶[]。Ji等从地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis) 中克隆出丝氨酸蛋白酶，也证实其具有抗真菌的能力[]。

脂肽类抗生素是非核糖体合成的次级代谢产物，其结构含有肽链和脂肪烃链，从结构上可分为环状脂肽和线性脂肽[]。环状脂肽类抗生素是一类结构新颖的环状肽类，包括单环肽和双环肽，是一种特殊的分子模式，可作为抗生素、生物表面活性剂等，在生物防治和药物开发等方面广泛应用。非核糖体机制已被运用在肽合成，通过采用多酶复合物逐步催化合成环化肽。而脂肽的作用机制取决于其两亲性性质及其与靶生物细胞膜相互作用的能力，含有亲水性氨基酸，在pH调节下分子带负电荷，具有很好的水溶性；脂肪酸链和疏水性基团具有很好的脂溶性，容易与细菌磷脂层反应，由此决定了其良好的抗菌效果[]。由芽孢杆菌和类芽孢杆菌属产生的大量脂肽可归类为环状阳离子脂肽。它们在C-端通过酯键或酰胺键进行环化，通过非核糖体酶生物合成环脂肽[]。其他来自芽孢杆菌的环脂肽可广泛归类为环非阳离子脂肽，它们包括伊枯草菌素、表面活性素、丰原素和镰刀菌素。还有一类线性阳离子脂肽是从蜡样芽孢杆菌中分离得到的蜡样芽孢毒素。它们对革兰氏阳性微生物，包括金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌，具有很强的抗菌活性[]。

芽孢杆菌菌株主要通过抑制植物病原菌的生长、诱导植物的系统抗性以及与植物病原菌争夺生态位来表现其生物防治能力[]。枯草芽孢杆菌是工业上生产活性脂肽应用最广泛的微生物之一。枯草杆菌还可以分泌多种酶和抗生素，因此在农业、食品、医药和饲料生产中得到了广泛的应用。先前的研究已经报道，蜡样芽孢杆菌菌株在体外或体内表现出对米曲霉的抗真菌活性，可被开发为控制稻瘟病的杀菌剂[-]。这些研究为杀菌剂的开发提供了良好的前期研究。本研究从环境中筛选出具有较强蛋白水解酶的芽孢杆菌菌株，再进一步利用拮抗分析其抗真菌能力，获得一株具广谱抗真菌的细菌，命名为X49，再从分子、生理生化及形态特征鉴定出此菌株，从此菌株的基因组研究发现，其具有多种的非核糖体合成酶及蛋白水解酶，我们进一步研究此菌株培养液胞外蛋白水解酶的活性特征，同时与不同中药共发酵培养，提取出脂肽类发酵化合物，也发现此中药发酵提取物具有明显的抑制真菌功效。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株

本研究所用真菌串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme) CICC2490、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii) CICC40716、绳状青霉(Penicillium funiculosum) CICC40279、镰孢菌(Fusarium concentricum) CICC41030、黄肉座菌(Hypocrea lutea) CICC40381及黑曲霉(Aspergillus niger) CICC40374购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar) 及马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth)，购自广东环凯微生物科技有限公司。

LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10；固体培养基加琼脂粉20。

胰蛋白胨大豆琼脂(tryptose soya agar)，购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.3 主要试剂和仪器

细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、PCR扩增试剂盒、引物合成，购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；API试纸条，购自生物梅里埃法国股份有限公司；偶氮酪蛋白、源于米曲霉蛋白酶(protease from Aspergillus oryzae) 购自西格玛奥德里奇(上海) 贸易有限公司；孜然、干姜、花椒、川椒、独活、广藿香、白芍及细辛，购自北京同仁堂中药材有限公司。

PCR，C1000 TOUCH，Bio-Rad公司；高速离心机，MIKRO 220R，德国Hettich科学仪器有限公司；摇床培养箱，THZ-98C，上海一恒科学仪器有限公司；冷冻干燥机，EYELA PDU-1200，东京理化器械株式会社；电泳仪，Tanon EPS 300、凝胶成像仪，Tanon 2500，上海天能科技有限公司；pH计，NanoDrop，Thermo Fisher公司；酶标仪，SpectraMax，美谷分子仪器(上海) 有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 菌株筛选及生长特性分析

利用蛋白水解酶培养基(LB琼脂培养基及1%脱脂奶粉) 筛选来自福建省厦门市、福建省泉州市晋江市、江西省赣州市会昌县等地的菌株，将筛选到透明圈较大的菌株与真菌(F. moniliforme CICC2490, P. variotii CICC40716, P. funiculosum CICC40279, F. concentricum CICC41030, H. lutea CICC40381及A. niger CICC40374) 在PDA琼脂培养基上进行拮抗分析。筛选到具有明显抗真菌能力的菌株命名为X49。利用LB液体培养基，在摇床培养箱中(150 r/min) 培养，针对其不同的培养温度及pH值进行探讨。同时配制含有不同NaCl浓度的LB固体培养基，利用划线方式进行菌株培养观察。

1.2.2 16S rRNA基因测序

利用LB培养基培养X49菌株后，离心收集菌体，用DNA抽提试剂盒进行总DNA的提取。使用16S rRNA基因通用引物(27F: 5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 1492R: 5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′) 进行PCR扩增，扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；最后再以72 ℃ 7 min完全延伸。PCR完成及纯化后，由金唯智公司进行DNA测序。通过MEGA软件分析16S rRNA基因的系统发育树，比较不同微生物的分类[]。

1.2.3 电镜扫描分析

委托厦门市自然资源部第三海洋研究所进行电镜扫描分析。将X49菌株培养在LB平板上，利用配备有Quorum PP3000T (Quorum Technologies Ltd.) 的扫描电子显微镜(FESEM; FEI Quanta 450 FEG FESEM) 分析X49菌株的形态。琼脂样品在室温下用液氮玻璃化，之后在−200 ℃下，经过12 min升温至−90 ℃，然后涂覆铂金。利用电子束强度为15 kV的FESEM (FEI Quanta 450 FEG FESEM) 获得样品图像。

1.2.4 API测试

利用3种试纸条(API ZYM、API 20E、API 50 CH) 检测菌株对不同底物的代谢情况，用接种环蘸取适量X49菌液在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上进行划线培养，然后放入培养箱中，24 h后利用接种环挑取单一菌落并将其溶于生理盐水中，吹打混匀，再加入试纸条中，最后放入培养箱，4 h、24 h或48 h后观察试纸条的颜色变化，根据颜色变化来判断实验菌的生化特性。

1.2.5 基因组测序和注释

将获得的X49菌株的基因组数据，利用二代测序(next-generation sequencing, NGS) 方法进行分析。首先提取X49菌株的基因组DNA，获得其DNA的OD260/280在1.8–2.0范围内，然后将此DNA委托金唯智公司(苏州) 进行文库构建、全基因组测序和基因组生物信息分析。测序仪使用Illumina Novaseq 6000 (Illumina, 美国)，使用2×150配对末端(PE) 进行测序。Prodigal软件作为编码基因的搜索[]。进一步使用BLASTP在NCBI数据库中搜索基因。功能性基因由gene ontology进行注释[]。代谢路径则由KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) 注释[]。基因编码的蛋白质通过COG (clusters of orthologous groups) 数据库进行系统发育分类。X49菌株的基因组序列已上传到NCBI数据库，Bioproject编号为PRJNA769515，Biosample编号为SAMN22138608。

1.2.6 蛋白水解酶活性分析

参照Azeredo等的方法进行偶氮酪蛋白活性分析[]，取30 μL的样品或未接入菌种的培养基、270 μL 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)、250 μL含2%偶氮酪蛋白的50 mmol/L磷酸缓冲液，混匀，37 ℃水浴30 min，加入150 μL 10%三氯乙酸，离心取上清，在440 nm处测定蛋白酶活性。其中未接入菌种的培养基作为空白对照。采用阳性对照品源于米曲霉蛋白酶(protease from Aspergillus oryzae) (酶活性为500 U/mL)，梯度稀释测其OD440，制作标准曲线。在偶氮酪蛋白活性分析的基础上，改变检测反应温度进行蛋白酶活性分析。

1.2.7 中药共发酵培养及脂肽类抗菌活性物质的纯化

取适量中药磨成细粉，称取2 g加入锥形瓶中，加入50 mL蒸馏水，高压灭菌。按1︰100接入菌种，150 r/min、30 ℃培养10 d。参照Chen和Juang的方法[]提取脂肽类抗菌活性物质。将发酵液离心后收集上清液并去掉菌体，用浓盐酸将上清液pH值调到4左右，并且在4 ℃下保存24 h，之后离心(4 ℃，10 000 r/min，15 min) 收集沉淀，冷冻干燥后称重记录，以获得脂肽类抗菌活性物质。取固定重量提取后的脂肽类抗菌活性物质，加入适量体积二甲基亚砜溶解，将其配制成浓度为10、5、2.5、1.25 mg/mL的溶液，再经0.22 μm无菌过滤器过滤。以加入2 g中药细粉和50 mL蒸馏水为对照组，高压灭菌后收集上清液，按以上方法获得纯中药提取物，然后配制相同浓度的溶液，利用0.22 μm无菌过滤器过滤。

1.2.8 抗真菌活性分析

将F. moniliforme CICC2490在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养，利用马铃薯葡萄糖肉汤刮取平板上的孢子，使孢子溶液的OD600处于0.1–0.2之间。在96孔板内加入190 μL的菌液和10 μL不同浓度的发酵提取物溶液，每个浓度设置3个平行实验。另取一块96孔板，分别加入190 μL菌液和10 μL纯中药提取物溶液，作为对照实验，同时设置一个阴性对照组(190 μL菌液加10 μL的二甲基亚砜溶液)。将96孔板放入25 ℃培养箱中培养72 h进行观察，并检测OD600值。

2 结果与分析 2.1 菌株筛选及生长培养分析

本研究从福建省厦门市、福建省泉州市晋江市、江西省赣州市会昌县等地的土壤筛选出215株菌株，利用蛋白水解酶的培养基观察其透明圈，从结果可看出大部分菌株具有较弱的蛋白水解酶活性，只有其中4株菌株的透明圈较大，其透明圈与菌株直径比例超过3倍。同时将此4株菌株进行抗真菌的分析，发现菌株X49具有广谱的抑制真菌功效，对F. moniliforme CICC2490，P. variotii CICC40716，P. funiculosum CICC40279，F. concentricum CICC41030，H. lutea CICC40381及A. niger CICC40374都有明显的拮抗作用()。此外，X49菌株在10–50 ℃的范围内均可以生长，在35 ℃可达最高生长密度()，且在pH 4.0–9.0范围内均有明显的生长。在含有不同氯化钠浓度(1%、2%、5%、7%及10%) 的LB平板培养基上培养观察，结果显示X49菌株对环境盐浓度的适应性较强，在10% NaCl浓度下仍然能够生长。

 
图 1 X49菌株与不同真菌在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上的拮抗分析 Fig. 1 Antagonistic analysis of Bacillus sp. X49 against different fungi on PDA plate.  

 

 
图 2 X49菌株在不同温度(A) 及pH (B) 条件下培养72 h后的菌体生长密度 Fig. 2 Cell density of Bacillus sp. X49 cultivated under different temperature (A) and pH (B) for 72 h.  

 

2.2 X49菌株16S rRNA基因测序及形态分析

使用16S rRNA基因通用引物扩增X49菌株的16S rRNA基因，结果显示可扩增出大约1.5 kb长度的DNA片段，经由DNA测序后，通过NCBI数据库进行BLAST分析，显示X49与Bacillus菌属同源性较高。进一步选取Bacillus不同种的模式菌株构建系统发育树()，对比结果显示X49菌株与甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus) CBMB205T的同源性最为接近。X49菌株在LB平板培养基上呈现乳白色外观，根据扫描电镜分析其外观形态()，菌体呈现杆状，其大小约为0.5 µm×(1–2) µm，从电镜图可见菌株以单个或成对排列，少数成短链排列。

 
图 3 X49菌株与不同种Bacillus模式菌株的16S rRNA基因系统发育树 Fig. 3 16S rRNA gene-based phylogenetic tree of different Bacillus type strains including Bacillus sp. X49.  

 

 
图 4 X49菌株在LB平板培养基上的扫描电镜分析 Fig. 4 SEM analysis of Bacillus sp. X49 grown on LB plate.  

 

2.3 X49菌株生理生化分析

X49菌株与B. methylotrophicus CBMB205T[]、漳州芽孢杆菌(Bacillus zhangzhouensis) 及南海芽胞杆菌(Bacillus australimaris)[]的API ZYM反应进行对比()，X49菌株对碱性磷酸酶、酯酶C4、类脂酯酶C8、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶呈现阳性反应，相较于B. methylotrophicus CBMB205T模式菌株具有较多种类的酶活性。API 20E测试则只有丙酮酸盐及明胶呈现阳性反应。此外，API 50CH测试显示甘露醇、L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵柠檬酸铁、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-密二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、菊粉、D-松三糖、D-棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇及D-龙胆二糖呈现阳性反应。

表 1 芽孢杆菌X49菌株与芽孢杆菌模型菌株的表型特征比较 Table 1 Phenotypic comparison among X49 strain and other type strains of Bacillus

Characteristic   X49   1   2   3  
Pigmentation   Creamy white   Creamy white   Creamy white   Light yellow  
Growth in 10% NaCl   +   –   +   +  
Maximum growth temp (℃)   50   45   45   45  
Minimum growth temp (℃)   10   15   8   8  
Alkaline phosphatase   +   +   +   +  
Esterase (C4)   +   +   +   +  
Esterase lipase (C8)   +   +   +   +  
Lipase (C14)   –   –   w   w  
Leucine arylamidase   +   –   +   –  
Valine arylamidase   –   –   w   –  
Cystine arylamidase   –   –   –   w  
Trypsin   –   –   –   –  
Chymotrypsin   +   –   +   +  
Acid phosphatase   +   –   +   +  
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase   +   +   +   +  
α-galactosidase   –   –   –   –  
β-galactosidase   –   –   +   +  
β-glucuronidase   –   –   –   w  
α-glucosidase   +   +   –   –  
β-glucosidase   +   －   +   +  
N-acetyl-β-glucosaminidase   –   –   –   –  
α-mannosidase   –   –   w   –  
α-fucosidase   –   –   –   –  
DNA G+C content   46.5   45   41.4   41.3  
1: B. methylotrophicus; 2: B. zhangzhouensis; 3: B. australimaris. +: positive; –: negative; w: weakly positive.  

2.4 X49菌株基因组测序分析

X49菌株经基因组测序后，共获得23 318 120个reads及3 483 188 362个bp ()，将其进行拼接，只有31个contig，显示DNA测序的完整度较高。经过生物信息分析，X49菌株基因组全长为3 929 913 bp，共有3 766个基因，G+C含量占比为46.55%，相较于B. methylotrophicus FKM10及B. methylotrophicus B25都较为接近。此外，X49菌株非编码RNA的数量为189个。分析可能参与抗菌的丝氨酸蛋白酶() 及非核糖体肽合成酶()，结果显示共发现11个编码的丝氨酸蛋白酶，其中包含有S8枯草杆菌蛋白酶家族(subtilisin family)，S1-C亚家族(subfamily)，扁菱形蛋白家族(rhomboid family)，V8-like Glu-specific内肽酶(endopeptidase) 及ATP-dependent蛋白水解酶(protease)。根据非核糖体肽合成酶的分析显示，共有30个编码的非核糖体肽合成酶，其中包含有表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、杆菌肽及短杆菌肽非核糖体肽，另有10个未知参与何种非核糖体肽的编码基因。

表 2 芽孢杆菌X49菌株和已发表的B. methylotrophicus基因组序列概要 Table 2 Summary of the genomic features of Bacillus sp. X49 and the published B. methylotrophicus

Category   X49   NKG-1   FKM10   B25  
Total reads after quality trim   23 318 120   –   –   –  
Total base after quality trim (bp)   3 483 188 362   –   –   –  
Total number of contigs   31   –   –   –  
Genome size (bp)   3 929 913   4 197 217   3 928 789   3 862 757  
Gene annotation   3 766   4 432   3 783   3 679  
GC%   46.55   47.06   46.49   46.7  
Total ncRNA   189   228   –   –  
References   This study   []   []   []  

表 3 芽孢杆菌X49菌株中的丝氨酸蛋白酶 Table 3 Serine proteases present in Bacillus sp. X49

Serine proteases   Gene ID   Amino acids   Homologous accession number   Protein identity   Homologous species  
S8 subtilisin family   1_499   319   WP_014304883   319/319 (100%)   Bacillus sp.  
1_894   442   WP_024085327   442/442 (100%)   Bacillus sp.  
S1-C subfamily   2_85   398   WP_015387437   398/398 (100%)   Bacillus sp.  
2_563   396   WP_060387189   396/396 (100%)   Bacillus amyloliquefaciens  
Rhomboid family   6_121   199   WP_057080626   199/199 (100%)   Bacillus amyloliquefaciens  
V8-like Glu-specific endopeptidase   5_221   303   WP_003155497   303/303 (100%)   Bacillus sp.  
ATP-dependent protease   1_541   698   WP_043867039   697/698 (99%)   Bacillus velezensis  
2_621   198   WP_003151513   198/198 (100%)   Bacillus sp.  
3_250   420   WP_003152620   420/420 (100%)   Bacillus sp.  
3_251   552   WP_003152622   552/552 (100%)   Bacillus sp.  
8_4   810   WP_007410388   810/810 (100%)   Bacillus sp.  

表 4 芽孢杆菌X49菌株中的非核糖体肽合成酶 Table 4 Non-ribosomal peptide synthetases present in Bacillus sp. X49

NRPS   Gene ID   Amino acids   Homologous genes   Homologous accession number   Protein identity   Homologous species  
Surfactin   6_1   654   SrfAB   WP_046559337   654/3 586 (18%)   Bacillus velezensis  
6_2   1 278   SrcAC   WP_044053264   1 278/1 278 (100%)   Bacillus subtilis  
6_3   243   SrfAD   WP_014304324   243/243 (100%)   Bacillus sp.  
7_1   2 613   SrfAA   WP_057080002   2 613/2 711 (96%)   Bacillus amyloliquefaciens  
13_1   2 610   SrfAB   WP_101311882   2 610/3 586 (73%)   Bacillus velezensis  
13_2   649   SrfAA   WP_139885552   649/3 584 (26%)   Bacillus velezensis  
18_1   414   SrfAA   WP_219194687   414/3 584 (12%)   Bacillus velezensis  
Iturin   1_995   2 617   ItuC   WP_173602848   2 617/2 617 (100%)   Bacillus velezensis  
1_996   5 362   ItuB   WP_173602849   5 362/5 362 (100%)   Bacillus velezensis  
1_997   3 982   ItuA   WP_173602850   3 982/3 982 (100%)   Bacillus velezensis  
Fengycin   4_367   2 552   FenA   WP_201488931   2 551/2 552 (99%)   Bacillus velezensis  
4_368   2 565   FenB   WP_073982297   2 564/2 565 (99%)   Bacillus amyloliquefaciens  
4_369   1 173   FenC   WP_208557787   1 173/1 173 (100%)   Bacillus amyloliquefaciens  
12_1   2 201   FenD   WP_215601758   2 201/2 201 (100%)   Bacillus velezensis  
12_2   1 422   FenC   WP_215601759   1 422/1 422 (100%)   Bacillus velezensis  
Bacitracin   14_1   1 414   BacA   WP_139891865   1 414/1 414 (100%)   Bacillus velezensis  
Gramicidin   2_565   219   LgrE   WP_088005439   219/219 (100%)   Bacillus velezensis  
3_37   177   GrsT   WP_079979109   177/177 (100%)   Bacillus velezensis  
7_114   2 442   GrsB   WP_164691742   2 442/2 442 (100%)   Bacillus velezensis  
14_2   977   GrsB   WP_208557997   977/977 (100%)   Bacillus amyloliquefaciens  
NRPS   1_1021   1 267   NRPS   WP_069013589   1 267/1 267 (100%)   Bacillus sp.  
NRPS   1_1022   1 293   NRPS   WP_101311967   1 293/3 591 (58%)   Bacillus velezensis  
NRPS   2_895   2 375   NRPS   WP_052586507   2 375/2 375 (100%)   Bacillus amyloliquefaciens  
NRPS   3_39   1 371   NRPS   WP_213403547   1 085/1 157 (94%)   Bacillus velezensis  
NRPS   7_109   2 206   NRPS   WP_069013416   2 205/2 206 (99%)   Bacillus velezensis  
NRPS   10_43   834   NRPS   WP_024084831   834/3 568 (23%)   Bacillus amyloliquefaciens  
NRPS   15_1   670   NRPS   WP_131258854   670/670 (100%)   Bacillus velezensis  
NRPS   24_1   189   NRPS   WP_225046443   187/189 (99%)   Bacillus amyloliquefaciens  
NRPS   25_1   202   NRPS   WP_227560965   181/183 (99%)   Bacillus velezensis  
NRPS   30_1   93   NRPS   WP_222122394   92/93 (100%)   Bacillus velezensis  
a Homologous gene of Bacillus spp. with whole genome.  

2.5 X49菌株蛋白水解酶活性分析

根据阳性对照进行不同浓度稀释得出酶活性标准曲线()，将X49菌株胞外培养液换算成U/mL，结果显示在15 ℃培养72 h后，其酶活性呈现最高，其余温度条件酶活性基本呈下降趋势()。在不同pH条件下培养72 h，X49菌株在pH 6.0条件下生长的酶活性最高，在pH 4.0–5.0及pH 7.0–8.0条件下呈下降趋势，pH 3.0及pH 9.0培养基中生长72 h后，则不具有酶活性。将菌株接种于LB液体培养基中，于15 ℃的环境中培养72 h，测其在不同温度条件下培养液与底物反应的酶活性，结果显示胞外蛋白水解酶在45 ℃条件下活性最高，即使温度升高至55 ℃，其活性仍维持在45 ℃条件下的91%。当反应温度超过70 ℃或低于15 ℃时，活性才大幅下降。

 
图 5 阳性对照品源于米曲霉蛋白酶(Merck) 的标准曲线 Fig. 5 Standard curve of protease from Aspergillus oryzae (Merck), which is used as a positive control.  

 

 
图 6 不同培养温度(A)、培养pH (B) 及蛋白水解酶反应温度(C) 条件下X49菌株蛋白水解酶的活性 Fig. 6 Protease activity of Bacillus sp. X49 cultivated under different temperature (A), pH (B) and temperature of enzymatic reaction (C).  

 

2.6 X49菌株发酵提取物的抗真菌活性分析

将X49菌株与不同中药共发酵后，提取培养液中脂肽类化合物，以此提取物对 F. moniiliforme CICC2490生长的抑制作用进行探讨，结果显示使用LB培养基发酵后的提取物对该真菌具有明显的抑制作用，随着提取物浓度的升高，抑制率也明显增加()。但在第3天培养后，0.5 mg/mL提取物的抑菌率明显下降15%，其余浓度的抑菌率也都下降超过10%。此外，X49菌株与孜然、干姜、花椒、川椒、独活、广藿香、白芍及细辛培养后的提取物，经抑菌研究发现，纯中药干姜的提取物在浓度为0.5 mg/mL时，经第2天培养后不具有明显的抑制真菌功效，第3天培养后则完全失去抑制真菌能力，但与X49菌株共发酵后，0.5 mg/mL提取物在第2天培养后达到78%的抑菌率，第3天培养后也只稍微降到74%，在0.062 5 mg/mL低浓度时，X49菌株与干姜共发酵提取物的抑菌率是与LB培养基发酵后提取物的4.5倍。其余中药共发酵提取物的抑菌率也都没有比干姜的功效更好。进一步将X49菌株与干姜共发酵培养液进行涂盘培养，也确认X49菌株经过10 d培养后，菌落数可达约5.6×107 CFU/mL。

 
图 7 X49菌株与LB (A) 及干姜(B) 共同培养后的提取物对F. moniiliforme CICC2490生长的抑制影响分析 Fig. 7 Antifungal effect of the extract of the co-culture containing Bacillus sp. X49, LB medium and Zingiber officinale Rosc. on the growth of F. moniiliforme CICC2490. The 2 d-Zingiber and 3 d-Zingiber indicated the fungal inhibition rate by the extract of Zingiber officinale Rosc. against F. moniiliforme CICC2490 at 2 d and 3 d incubation. The fungal inhibition rate of 3 d-Zingiber was 0%.  

 

3 讨论

本研究筛选的菌株经过16S rRNA序列分析后，使用MEGA软件，采用邻接(neighbour-joining) 方法构建系统发育树[]。结果表明，X49菌株在系统发育上隶属于芽孢杆菌属。X49菌株与模式菌株B. methylotrophicus CBMB205、B. velezensis CR-502、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) ATCC 23350及死亡谷芽胞杆菌(Bacillus vallismortis) DSM 11031密切相关，显示出序列的相似性，其中X49菌株与模式菌株B. methylotrophicus CBMB205的相似度几乎为100%。模式菌株B. methylotrophicus CBMB205无法在超过4%的NaCl环境下生长[]，最优化的生长温度为28 ℃、pH为7.0，而本研究筛选出来的菌株X49对于NaCl的耐受度较高，并且有较广的生长温度。其形态大小特征与模式菌株B. methylotrophicus CBMB205 ((0.63–0.64)× (1.8–2.7) mm) 相似，并以单一或成对的菌株呈现。在针对API ZYM生化反应上，X49菌株也与模式菌株较为相近，但比模式菌株多出亮氨酸氨基肽酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶及β-葡萄糖苷酶4种酶活性。在利用API 50CH分析49种碳水化合物代谢情况时，发现X49菌株能够利用其中的30种不同碳水化合物。然而根据过去的研究显示，B. methylotrophicus及B. velezensis属于异模式异名(heterotypic synonym)[]，根据基因组分析，此2种模式菌株的基因组差异不大，B. velezensis的发现较B. methylotrophicus来得早[]，因此，本菌株可命名为B. velezensis X49。过去的研究显示，B. methylotrophicus菌株对于病原菌尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia sp.)、花生根结线虫(Meloidogyne hapla) 具有明显的拮抗作用[]，并且也属于一种植物促长根圈细菌(plant growth-promoting rhizobacterium, PGPR)[]，除了能有效抑制病原菌之外，对于促进植物生长也有所帮助，所以此菌株具有成为生物肥料的潜力。本研究也显示X49菌株对于植物(F. moniliforme) 及人类(P. variotii) 病原菌也都有很显著的抑制作用。

已有多篇的研究证实丝氨酸蛋白酶具有抗真菌的能力[, , ]，分析X49菌株基因组的丝氨酸蛋白酶发现，其基因编号1_894属于S8枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶，拥有442个氨基酸，分子量预估为48.2 kDa，其与Ji等[]报道具有抗真菌能力的丝氨酸蛋白酶有高达99%的相似度。该蛋白经实验证实对于果树病原真菌B. cinerea具有明显的抑制作用。丝氨酸蛋白酶主要会与底物中的羰基相互作用[]，达到水解蛋白的目的。它在生物体内具有广泛的生理作用，通过激活或抑制调节蛋白水解酶的前体，在细胞分化、凝聚、组织重建、胚胎发育及病原菌入侵上扮演很重要的角色[-]。这类家族的丝氨酸蛋白酶具有一个peptidase_S8的功能结构域(functional domain)，通常是由152到437个氨基酸组成，是枯草芽孢杆菌中数量排名在第二的家族。本研究经由胞外培养液的分析证实了X49菌株的蛋白水解酶活性，并且此胞外蛋白水解酶在45–55 ℃条件下，仍保有较高的酶活性，这与Ji等[]发现的耐高温丝氨酸蛋白酶有相似的结果。此外，本研究也发现X49菌株的胞外蛋白水解酶会受到低温诱导，当菌株在15 ℃培养条件下，胞外蛋白水解酶的活性达到最高，这在过去的研究中尚未被发现，值得进一步去探讨X49菌株如何调节蛋白水解酶的表达。

脂肽类是芽孢杆菌的次级代谢产物，其具有抑制病毒、细菌、真菌和肿瘤等多种活性，在农业和医学领域具有非常大的应用潜力[]。本研究经过基因组分析后发现，X49菌株有多达30个编码的非核糖体肽合成酶，其中包含已知的表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、杆菌肽及短杆菌肽脂肽类化合物。表面活性素、伊枯草菌素及丰原素是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 研究最多的脂肽类化合物。表面活性素主要会扰动或破坏细胞膜的完整性，达到抗菌的功效。除了抗菌之外，表面活性素还具有溶血、抗病毒、抗炎、抗肿瘤和免疫调节等活性[]。伊枯草菌素对于酵母菌及霉菌具有非常广谱的抑菌医药疗效，同样也被应用在农业领用。伊枯草菌素抑制真菌的作用机制类似表面活性素，它会与胆固醇形成化合物，影响细胞膜，并在其表面造成小孔洞[]。丰原素对于多种不同的病原细菌及真菌的抑制也多有报道，这类脂肽类化合物对细菌类的黄色微球菌(Micrococus flavus)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、普通变形菌(Proteus vulgaris) 及产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes) 与真菌类的意大利青霉(Penicillium italicum)、大刀镰刀霉(Fusarium culmorum)、B. cinerea、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 及小麦白粉病菌(Erysiphe graminis) 都具有明显的抑制作用[]。Bacitracin及Gramicidin均具有抗菌的功效。这些特征也表明芽孢杆菌在医疗及农业领域非常值得深入研究。根据Chen和Juang的研究显示[]，利用酸沉淀法对于脂肽类化合物的提取率可达53%，我们根据该方法进行小部分修改后，针对X49菌株进行脂肽类化合物的提取，并进行抗真菌的测试。结果发现在利用LB培养X49菌株的提取物对于F. moniiliforme CICC2490具有明显的抑制作用。除此之外，因为X49菌株具有丰富的酶系统，因此使用X49菌株与中药共发酵培养，期望除了产生有效的脂肽类化合物之外，还可透过对中药的生物转化，获得更多抗菌化合物，提高抗菌能力。有研究显示，枯草芽孢杆菌(B. subtilis) 与50种中药发酵培养后，只有连翘、土茯苓、射干、淡豆豉、王不留行及西青果在发酵后，其抑菌能力均有增强的现象[]。本研究在与孜然、干姜、花椒、川椒、独活、广藿香、白芍及细辛发酵培养后，相较于LB培养液，在与干姜发酵培养后的提取物能具有更高的抑菌功效。过去研究显示，干姜在利用乙醇及超临界CO2萃取后[-]，具有明显的抑菌效果，但在本研究以酸沉淀处理，对于F. moniiliforme CICC2490无显著的抑菌能力，但经由X49菌株的发酵后，抑菌功效则提高非常多，这表明X49菌株能将干姜的化合物进行有效的生物转化，使有效的活性成分提高，这些发酵化合物值得我们进一步去做单体化合物的纯化及分析，以作为未来药物的研究开发。