一种产气荚膜梭菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用的制作方法
本技术属于噬菌体，地毯清洗13825404095尤其涉及一种产气荚膜梭菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。
背景技术：
1、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)也称魏氏梭菌，是一种产芽胞的革兰氏阳性厌氧菌，广泛分布于土壤、饲料、污水、动物消化道和粪便中。该菌能够产生六种主要的致病毒素(α、β、ε、ι、β2和肠毒素)，为能够引起人类食物中毒和动物坏死性肠炎的食源性病原，在动物产品生产过程中引发疾病并通过加工环节传播，威胁人类健康，同时给养殖行业带来巨大经济损失。产气荚膜梭菌是引起动物坏死性肠炎(necrotic enteritis,ne)的主要病原，造成较大经济损失。
2、抗生素长期使用和滥用导致产气荚膜梭菌的耐药性问题日益严峻，鸡源、猪源和羊源性产气荚膜梭菌的耐药率分别达到66％，82％和100％，且对红霉素、林可霉素、新霉素、四环素和环丙沙星的耐药率很高，此外耐药基因和毒力基因可通过质粒在产气荚膜梭菌中传播和扩散，使得产气荚膜梭菌的防治更加困难。
3、噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具有自我高效复制、特异针对病原、不影响正常菌群且不产生抗性等特点，目前在国外已有较多成功应用的报道，在替代抗生素防治产气荚膜梭菌感染方面有巨大的潜力。
4、相关技术公开了一种并可以特异性地杀死产气荚膜梭菌细胞的肌尾噬菌体科(myoviridae)噬菌体clo-pep-1，以及预防产气荚膜梭菌感染和之后使用包含所述噬菌体的组合物作为活性成分治疗的方法。
5、相关技术公开了一种包含4株新型产气荚膜梭菌噬菌体的噬菌体组合物，并利用所述组合物用于制备裂解产气荚膜梭菌产品，用于养殖企业产气荚膜梭菌感染的防治，从而减少养殖企业抗生素的使用量，提高企业的经济效益。
6、上述中的现有技术方案存在以下缺陷：上述产气荚膜梭菌噬菌体的裂解能力或对50℃以上的高温环境的耐受性均有限，亟需提供一种新的产气荚膜梭菌噬菌体。
技术实现思路
1、本技术针对现有技术的不足，提供了一种新的产气荚膜梭菌噬菌体，所述产气荚膜梭菌噬菌体的裂解能力强，且能够耐受55～70℃以上的高温环境，能够较好地应用在产气荚膜梭菌相关疾病的防治中。
2、为此，本技术第一方面提供了一种产气荚膜梭菌噬菌体，所述噬菌体为产气荚膜梭菌噬菌体p2acqjs03(clostridiumperfringens phage p2acqjs03)，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctcc no: m 20242430。
3、在一些实施方式中，所述噬菌体具有一呈多面体立体对称的头部及一个短收缩尾部，头部直径40～50nm，尾部尾长10～13nm，尾部直径4～6nm。
4、在一些实施方式中，所述噬菌体在moi＝0.001条件下培养4h，其效价高达2.2x1013pfu/ml。
5、本技术中，感染复数(moi)是噬菌体数量与细菌数量的比值，是研究噬菌体感染细菌与产出噬菌体子代量效关系的重要依据。本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体只需添加适量，即可侵染产气荚膜梭菌增殖获得大量子代噬菌体。因此，本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体能够工业化生产生物杀菌剂提供了优质噬菌体菌株来源。
6、在一些实施方式中，所述噬菌体在温度为55～70℃的条件下具有耐受性。
7、本技术中，所述“耐受性”指的是所述产气荚膜梭菌噬菌体在温度为55～70℃的条件下进行培养时的效价相较于在最适温度下进行培养时的效价仅略微下降，但其数量级未发生改变。本技术所述产气荚膜梭菌噬菌体能够耐受高温环境，进而能够满足特异性的需求。
8、本技术中，所述产气荚膜梭菌噬菌体在ph＝4～11的条件下具有良好的稳定性，同时所述噬菌体在酸性条件下耐受性良好，对碱性条件具有一定耐受性。
9、本技术第二方面提供了一种噬菌体组合物，所述组合物包括如本技术第一方面所述的产气荚膜梭菌噬菌体。
10、在一些实施方式中，所述组合物还包括化学性杀菌剂中的至少一种。
11、本技术对所述组合物中的化学性杀菌剂的具体种类没有明确限定，本领域的技术人员可以进行常规选择。例如，所述化学性杀菌剂可以为浓度为0.05％的双癸基二甲基氯化铵和浓度为0.01％的新洁尔灭中的任意一种。作为示例性的说明，所述产气荚膜梭菌噬菌体与化学性杀菌剂的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
12、本技术第三方面提供了一种生物杀菌剂，所述生物杀菌剂适用于裂解产气荚膜梭菌，所属生物杀菌剂的制备应用有所述的产气荚膜梭菌噬菌体或所述的用于裂解产气荚膜梭菌的噬菌体组合物；所述生物杀菌剂的剂型为溶液剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或冻干剂中之一。
13、本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体或噬菌体组合物，可以特异性地杀灭环境中的产气荚膜梭菌，因此可以应用于制备用于杀灭产气荚膜梭菌的生物杀菌剂中。所述生物杀菌剂可以杀灭产气荚膜梭菌，进而改善环境中的微生物分布；同时所述生物杀菌剂也可以喷洒于食品生产车间，防治食品加工过程中产气荚膜梭菌及其他细菌的污染。
14、本技术第四方面提供了一种药物，所述药物适用于治疗或预防由产气荚膜梭菌感染所引起的疾病，所述药物的制备应用有所述的产气荚膜梭菌噬菌体。
15、本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体可以高效且特异性地杀灭产气荚膜梭菌，因此可以应用于制备用于治疗或预防由产气荚膜梭菌感染所引起的疾病的药物中。当动物进食所述药物后，药物内的所述产气荚膜梭菌噬菌体能够特异性的杀灭动物体内的产气荚膜梭菌，进而可以治疗或预防由产气荚膜梭菌感染所引起的疾病。
16、本技术中，术语“治疗”表示(i)抑制由产气荚膜梭菌细胞引起的疾病；和(ii)缓解由产气荚膜梭菌细胞引起的疾病。
17、本技术第五方面提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂的制备应用有所述的产气荚膜梭菌噬菌体。
18、由于本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体可以高效且特异性地杀灭产气荚膜梭菌，因此将含有上述产气荚膜梭菌噬菌体的饲料添加剂添加于饲料中，可特异性、持续性地防治饲料生产储存及动物养殖中产气荚膜梭菌的污染。此外，还可抑制动物肠道中产气荚膜梭菌的感染，增强动物抵抗力。
19、本技术具有如下有益效果：
20、(1)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体，具有极强的耐高温能力，可以特异性地部分或完全灭活产气荚膜梭菌，为工业化生产噬菌体杀菌剂提供噬菌体株来源；
21、(2)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体是从自然界中分离获得的烈性噬菌体，经毒理实验证明其安全、无任何副作用；供试噬菌体dna无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白，且不含毒力基因或不良基因；本技术未对供试噬菌体进行任何遗传修饰；
22、(3)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体在产气荚膜梭菌宿主内较好地增殖，因此可进行大规模发酵培养；
23、(4)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体与非宿主细菌的互作，无法识别供试非宿主细菌中的任何一株，特异性良好；
24、(5)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体对其他联用物质无拮抗作用，同时可以和化学性杀菌剂进行联用；所述的产气荚膜梭菌噬菌体可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、灌溉设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性；所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、tsb培养基、lb培养基、氯游离水等；
25、(6)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体可用于制备组合物、试剂或试剂盒，应用于产气荚膜梭菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的产气荚膜梭菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度；
26、(7)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体可以有效杀灭肉类食品表面的产气荚膜梭菌并防治肉类食品在保存过程中产气荚膜梭菌的污染，可作为食品防护的各种产品的有效成分。本技术包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由产气荚膜梭菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等；
27、(8)本技术所述的产气荚膜梭菌噬菌体可以单独或混合使用，可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成生物杀菌剂，饲料添加剂及治疗药物，应用于治疗或预防由产气荚膜梭菌引起的感染性疾病。可被产气荚膜梭菌染的寄主包括人类、家畜(猪、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭、鹅等)，以及各种兽类、鱼类、鼠类等。