辣椒内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)防病促生作用的研究
摘要：
本研究对辣椒内生细菌及其拮抗菌进行了分离筛选,着重对其中2株分别来自辣椒叶片和茎杆的BS-2和BS-1菌株的鉴定,内生定殖,防病促生作用及其机制,B-2菌株的抗菌物质和发酵条件等进行了研究. 辣椒内生细菌分离结果表明,在所选用的分离条件下,辣椒组织体内含有2.83×10~3～1.35×10~4 cfu/g(fw)的细菌;不同品种或同一品种不同组织器官内,体内细菌的数量有所不同,叶片内细菌的含量最高,果中最少,叶,根,茎和果中细菌含量分别为3.4×10~3～4.5×10~4 cfu/g(fw),0.75×10~3～1.3×10~3 cfu/g(fw),0.1×10~3～3.25×10~3 cfu/g(fw)和0.3×10~3～1.8×10~3 cfu/g(fw).室内拮抗作用测定表明,所获得的108株细菌中,有31株(占28.7%)对香蕉,黄瓜枯萎病等10多种植物病原真菌具有拮抗作用,其中以分别来自辣椒叶片和茎杆中的BS-2和BS-1菌株的拮抗作用最强,最稳定.经形态和生化特征等测定,上述具有拮抗作用的31株细菌均为芽孢杆菌(Bacillus spp.);其中BS-2和BS-1菌株经Biolog鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis),再经16S rRNA序列分析比较,2菌株进一步鉴定为枯草芽孢杆菌内生亚种(B.subtilis subsp.endophyticus). 以抗利福平(300μg/ml)和拮抗病原真菌双抗性为标记,测定BS-2和BS-1菌株的内生定殖寄主范围及其在辣椒和白菜体内的定殖动态表明,浸种,灌根和涂抹叶片等方法接种,两菌株均可以进入辣椒,茄子,白菜,甜瓜,西瓜,丝瓜等植物体内定殖,除此之外,BS-2菌株还可以在蕃茄,黄瓜,豇豆,水稻和小麦等植物体内定殖;BS-2菌株的内生寄主范围比BS-1菌株广,内生定殖作用强.室内测定2菌株在辣椒体内和室外田间测定BS-2在白菜体内定殖动态表明,浸种,灌根及涂抹叶片等方法接种后,菌株均可主动进入辣椒和白菜体内定殖,并迅速向接种点上部,未接种的组织器官转移传导,并可在辣椒和白菜体内长期定殖. 室内盆栽和大田小区试验测定菌株对植物生长作用影响表明,BS-2和BS-1菌株对辣椒,白菜等作物有明显的促进生长作用.室内盆栽测定,菌液浸种辣椒,出苗后15d鲜重分别增加146.72%和58.58%;大田小区测定,菌液浸种辣椒苗鲜重分别增加72.02%和63.04%;菌液浸种白菜20d后鲜重分别增加91.20%～138.04%和25.43%～55.43%;BS-2菌株比BS-1菌株的促生作用 福建农林大学博士学位论文 强.BS一2菌株浸种处理辣椒和白菜后,植株内源激素测定表明,菌株浸种处 理后,植株体内的生长素(IAA),玉米素(ZR4)和赤霉素(GA3)等激素 的含量比清水对照高,而脱落酸(ABA)含量比对照减少.菌株进入植株体 内后,调节其内源激素的变化可能是菌株促生作用的主要机制之一. 室内防病测定表明,BS一2和BS一1菌株对辣椒炭疽病,白菜炭疽病和香 蕉炭疽病均有良好的预防效果.BS一2菌株对辣椒苗,辣椒果,白菜和香蕉炭 疽病的防治效果分别为:51.49%一93.34%,50.00/0一100%,45.120/0和71.54%; BS一1菌株对上述各病害的防治效果分别为:66.13%一79.23%,60.0%一100%, 68.45%和43.28%.BS一2菌株对植物炭疽病的防病效果比BS一1菌株高.防病 机制研究表明,菌株分泌抗菌物质抑制病菌菌丝生长,分生抱子产生和萌发, 主动进入植株内生定殖,优先占领病菌入侵位点,促进植株生长,增强寄主 生长势;诱导寄主植物过氧化物酶(POD),超氧化物歧化酶(s OD),过氧 化氢酶(CAf),苯丙氨酸解氨酶(PAL)等参与的植物防御性反应,降低寄 主植物体内的丙二醛(MAD)的产生等,可能是菌株防病的主要机制. BS一2菌株抗菌物质研究表明,其培养液经硫酸钱盐析,100℃处理30min, 可获得热稳定,抗紫外线,能强烈抑制植物病原真菌和细菌,并对辣椒炭疽 病具有69.79%(接种后gd)防病效果的抗菌物质;经SDS.PAGE,高效液相 色谱(HPLC),州叭上Dl一TOF质谱等检测,该物质为分子量为落2884.39Da的 多肤类物质. BS一2菌株发酵条件研究表明,以黄豆粉培养基培养,培养基初始pH值 6.7(灭菌后),温度为28℃,培养时间48h及良好的通气条件,为该菌株的 最佳发酵条件.