诺如病毒研究进展及一起邮轮诺如病毒感染疫情的实验室检测
1、诺如病毒研究进展及一起邮轮诺如病毒感染疫情的实验室检测,上海国际旅行卫生保健中心实验室 章琪 方筠 王家栋 Tel:021-62688086 Email: zhangq@shciq.gov.cn,食源性急性胃肠炎综述诺如病毒介绍案例介绍（一起邮轮诺如病毒感染疫情的实验室检测）,第一部分：食源性急性胃肠炎综述,食源性急性胃肠炎流行现状,
2、Source: Foodborne Outbreak Reporting System ,主要病原体：,毒素介导（Toxin-mediated): 水样便 病毒：诺如，日常保洁13825404095轮状，星状，腺病毒 细菌： 蜡样芽孢杆菌 ，产气荚膜梭菌，金黄色葡萄球菌 ，产肠毒素
3、 型大肠杆菌侵袭性病原体（Invasive microbes) :脓血便 细菌：大肠杆菌（侵袭性、致病性、出血性），沙门氏菌，空肠弯曲 杆菌，志贺氏菌，艰难梭菌 原虫：贾第鞭毛虫，溶组织内阿米巴渗透性病原体（Penetrating microbes): 系统感染 细菌：伤寒、副伤寒沙门氏菌，鼠疫杆菌,感染途径：,病人接触：诺如病毒、志贺氏菌、出血性大肠杆菌旅
4、行：大肠杆菌、沙门氏菌、贾第鞭毛虫 邮轮：诺如病毒（Cruise-ship virus）动物接触：沙门氏菌，出血性大肠杆菌，贾第鞭毛虫疫水：隐孢子虫，出血性大肠杆菌污染的食物：沙门氏菌,致病性：,感染剂量：（病原体颗粒数）隐孢子虫：10-100志贺氏菌：10-100出血性大肠杆菌：10-100空肠弯曲杆菌：104–106沙门氏菌：105–108霍乱弧菌：105–108产肠毒素型大肠杆菌：108鼠疫
5、杆菌：109,Slutsker L, et al. Ann Intern Med 1997; 126:505-13,食源性急性胃肠炎的防控仍然是很大的挑战！,诺如病毒：10-100,第二部分：诺如病毒介绍,历史：,In 1929, Zahorsky proposed the name “winter vomiting disease” to describes outbreaks of presumed viral gastro
6、enteritis In the 1940s, Gordon demonstrated that pooled stool filtrates obtained from patients in an institutional outbreak of nonbacterial gastroenteritis could infect inoculated volunteersIn 1968, CDC investi
7、gated an outbreak of vomiting disease in an elementary school in Norwalk OH: 50% of students and teachers developed gastroenteritisKaplan used immune electronmicroscopy to identify viral particles in the sto
8、ols of volunteers infected with the “Norwalk” strainVirus initially classified as small round viruses, later reclassified as caliciviruses when genome cloned, Dr. Albert Kapikian 1972, electron
9、microscopy Small Round-Structured Virus (SRSV) 27 nm,Kapikian AZ, et al. Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis
10、. J Virol, 1972, 10 (5): 1075-1081.,美国2006年诺如病毒引起的急性胃肠炎数量,流行现状：,自1995年我国报道首例诺如病毒感染以来，近年来在我国已有多起诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情的报道 ： 韩健康，沈建勇，姚文庭，等.一起诺如病毒Ⅰ型Ⅱ型混合感染急性胃肠炎暴发疫情调查分析.中华实验和临床病毒学杂志，2008,22(4): 263-265程慧健，袁辉，熊英，等.一起诺如病毒感染性腹泻暴发的
11、调查.中华流行病学杂志,2008,29(6):627-628钟培松，王韶华，陈时千，等. 一起福利院诺瓦克病毒胃肠炎暴发调查.中国预防医学杂志，2007，8(5):621-623林玫，刘巍，梁大斌，等. 诺如病毒引起的感染性腹泻暴发疫情调查.应用预防医学,2007,13(1):11-14,我国流行现状,1996年和1997年分别在北京和太原开展的人群血清标本中的诺瓦克样病毒特异性IgG抗体检测表明，北京市诺瓦克样病毒抗体总检出率为8
12、8.8％以上。太原市总检出率在78.6％以上。 1998-2002在福州地区用RT-PCR方法对288份腹泻患者粪便标本诺瓦克样病毒病原检测显示，诺瓦克样病毒基因组I的阳性率为11.1％，主要是7岁以上儿童及成人；诺瓦克样病毒基因组Ⅱ的阳性率为 28.8％，主要是6月龄至3岁婴幼儿。,我国流行现状,基本特征：,发病率高、致病剂量低、抵抗力强，被WHO定为B类病原体；对加热、低温具有较强抵抗性（能耐受零度以下到60℃）
13、；对酸碱和去污剂等具有较强的抵抗性 (通常10ppm或10mg/L含氯去污剂处理30分钟不能有效杀灭病原体）；无法培养，无有效小动物模型；型别众多，无有效保护性抗体，常引起重复感染；复制机制还不清楚，无有效治疗药物及疫苗,病原学：,TaxonomyFamily Caliciviridae Genus:1. Norwalk-Like Viruses (NLVs)2. Sapporo-Like Viruse
14、s (SLVs)Genus Noroviruses(formerly Norwalk-Like Viruses)Genus Lagovirus (rabbit, hare)Genus Vesivirus (cat, pig, sea lion, other)Genus Norovirus (human, bovine, swine, mouse)Genus Sapovirus (human, swine),Viri
15、ons ( 35 -40 nm ) nonenveloped and icosahedral,Genome structure：Linear positive sense RNA of 7.4 - 7.7 kb,,,,,,,,5',3',Hel,Pro,Pol,ORF 1,ORF 2,ORF 3,1,5,5358,5374,6950,6950,7588,7654,1789,530,212,,Capsid,Source:
16、 GenBank M87661,Clusters differ by ≥ 20% amino acid pairwise distanceGenogroups differ by 44-55% amino acid pairwise distance,病毒的分型（Capsid protein),1,病毒培养：,Cell culture: no (human strains)Animal model: no (chimpanzees)
17、,流行现状：Causes an estimated 23 million infections per year in the USCauses ~60% of illness due to knownAccounts for 70-95% of gastroenteritis outbreaks感染剂量: 10-100 viruses：传播途径： Fecal-oral transmission (she
18、dding for up to 2-3 weeks) Droplet transmission? (via ingestion of airborne droplets of virus containing particles) Common cause of traveler’s diarrhea May cause chronic infecti
19、on in transplant recipients,流行病学：,传播途径：,粪-口传播 Person-to-person Foodborne Waterborne Mixed空气传播 Vomitus污染物,传播途径分类：,临床症状：,腹泻86%呕吐78%腹部疼痛或绞痛 30%恶心（无呕吐） 15%嗜睡
20、8%发热7%肌肉疼痛7%头痛6%头晕4%脱水4%寒颤3%喉咙疼痛1%鼻出血1%,感染持续过程：,病毒颗粒持续释放过程：,诊断：,急性胃肠炎诊断标准（美国CDC标准)： 腹泻等于3次或者多于3次不成形粪便/24h;呕吐伴随一种以下症状如：1次或多次不成形便24/h、胃部不适、头疼、肌肉疼痛和发烧。邮轮疫情的定义：感染者通常〉3%邮轮总
21、人数。,实验室检测,(一)抗原检测1972年首先通过免疫电镜的方法发现NVs，因此该方法在很长一段时间内成为检测NVs的经典方法。电镜法包括常规电镜（EM）、免疫电镜（IEM）以及固相免疫电镜（SPIEM）三种。直接电镜法通过将粪便标本重悬后离心，负染病毒颗粒后直接在镜下观察来寻找病毒。由于NVs病毒颗粒并不具备典型的杯状病毒特征，且粪便中病毒滴度通常较低，给直接电镜观察带来了很大困难，通常要求病毒的滴度达到106/g才能达到检测
22、要求。免疫电镜的方法是将重悬离心分离得到的病毒颗粒与标准血清共孵育后再经负染后在镜下观察来检测病毒。尽管这种方法可以较好地浓缩病毒颗粒，但灵敏度仍然较低，对NVs检测的阳性率只有20%左右。固相免疫电镜的方法是将特异性抗体直接包被载网，同时加入蛋白A增加抗体与标本中抗原结合的机会，从而提高检测的灵敏度。上述三种方法都要求观察者具有丰富的经验，同时，精密的检测仪器、较大的劳动强度，都制约了该方法在NVs检测中的应用。,免疫学检测（EIA）
23、主要通过检测标本中的抗原来确认诺如病毒。该方法操作简单，实用性较强，便于推广。然而同样由于NVs型别的多样性，对该方法的应用产生了限制。 Bruin等在2006年首次报告了对两种新上市的商品化NVs EIA检测试剂盒的评估结果。结果表明，与传统的RT-PCR方法相比，IDEIA和Ridascreen这两个品牌的试剂盒对NVs的检测灵敏度分别为38%和36%，特异性为96%和88%。之后的两项评估结果虽然有提高，但灵
24、敏度也仅在60.%76.9%和59%80.3%之间。表明尽管对单个样品的诊断可能还存在问题，但可应用于NVs大规模暴发后的筛查。,(二)核酸检测,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：除了能更准确、灵敏地检测标本中的诺瓦克病毒，尤其是低浓度的诺瓦克病毒感染外，最大的优点在于可以进一步对病毒进行血清型和基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义，是诺如病毒检测的“金标准”。,Specimen Proces
25、sing (Faeces)Viral Recovery & RNA extractionGenerate cDNA from RNA by reverse transcriptionPCRNorovirus Genogroup I or II identified SequencingGenotyping,,,,,,实验流程：,,第三部分 一起邮轮诺如病毒感染疫 情的实验室检测,基本情况介绍,20
26、08年11月4日， 上海出入境检验检疫局接某大型邮轮报告，该船载有乘客2664人，乘务人员1087人，自10月22日从泰国曼谷起航后，船上陆续发现急性胃肠炎感染病例。感染人数在11月2日和3日达到高峰，至11月4日已达285人（截止11月6日符合急性胃肠炎症状的病例达368人）。上海出入境检验检疫局在接到报告后迅速启动紧急预案，多个部门通力合作，开展现场检疫查验和流行病学调查，明确事件性质；实验室迅速开展急性胃肠炎相关病原的快速检测，在
27、收到样品后3小时就初步确认引起这次大规模急性胃肠炎的病原为诺如病毒。这是检验检疫系统首次在口岸确诊大规模诺如病毒暴发疫情。,,Unpublished results by Wang J. and Zhang Z.,实验室诊断处置依据：,《上海国际旅行卫生保健中心腹泻病处置预案》,诊断原则,首先排除检疫传染病（霍乱）流行病学调查资料临床症状其它相关资料,,确定检测项目，检测方法,排查方案（一）,（一）轮状病毒：1． 金标法检测轮状
28、病毒抗原试剂：粪便轮状病毒检测试剂盒；试剂厂家：法国VEDA公司；样本：粪便；时间：30分钟。2．ELISA法试剂：轮状病毒酶免检测试剂盒；供应商：上海轩昊科技发展有限公司样本：粪便；时间：2小时。3．荧光定量RT-PCR法试剂：轮状病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒；单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；样本：粪便；时间：4小时。（二）诺如病毒1．ELISA法检测病毒抗原试剂：Enzyme i
29、mmunoassay for the detection of Norovirus in stool samples；厂家：R-Biopharm AG；样本：粪便；时间：4小时。2．半定量RT-PCR法（本实验室）样本：粪便；时间：6小时。,排查方案（二）,结果：,ELISA检测结果：,RT-PCR检测结果：,TIPS: for sample cellection1.最好采集水样便或稀便；2.最好采集发病48-72小时之
30、间的粪便样本；3. 直肠拭子或呕吐物标本一般作参考,电镜病毒颗粒观察结果,磷钨酸负染，40,000 电镜观察,检测过程总结：,诺如病毒进一步研究方向：,快速检测方法：Latex, LAMP,NASBA?分子流行病学：陆地—海洋循环进化规律消杀试剂,本次疫情处置的经验得失：,我国口岸首例，成功处置，找到病原体；锻炼了队伍，增强了职责、使命感，强化了疫情的观念；为口岸卫生检疫科研的开展、技术的储备明确了方向；各项细节有待完善,
31、邮轮突发传染病疫情相关动向：,军团菌： Legionella species colonization of water distribution systems, pools and air conditioning systems in cruise ships and ferries. BMC Public Health. 2008,8:390. 流感病毒： A large outbreak of influ
32、enza A and B on a cruise ship causing widespread morbidity. Epidemiol Infect. 2003,130(2):263-71. Large summertime influenza A outbreak among tourists in Alaska and the Yukon Territory. Clin Infect Dis. 2003,36(9)