一种防治立枯丝核菌病害的dsRNA纳米农药的制备及其应用
本发明涉及一种防治立枯丝核菌病害的dsrna纳米农药的制备及其应用，日常保洁13825404095涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。
背景技术：
1、立枯丝核菌（ rhizoctonia solani）是一种寄主多、分布范围广、腐生性强的土传病原真菌，由其引起的病害发生受环境影响较大，常用的农业和物理措施对其防效并不理想，生产上主要依靠化学药剂，但过量过频使用化学药剂易造成非靶标性杀灭及“3r”问题。因此，研发新的病害防治药剂和方法是当前立枯丝核菌病害研究的重要任务。
2、rna干扰（rna interference，rnai）是一种成熟的病原真菌基因功能研究和农作物病害防治方法，但以往基于rnai的技术均建立在转基因基础之上，而许多植物和病原真菌很难被遗传操作，再加上世界各国对转基因农产品接受度低，因此这些方法的安全性和广适性也一直倍受质疑。最近发展起来的喷施诱导的基因沉默技术（spray-induced genesilencing，sigs），不需要建立病菌遗传转化体系，也不需要形成转基因作物，只是通过外源喷施dsrna诱导病原物靶标基因沉默，从而达到控制病害的目的。相对于至目前为止还未有完善遗传转化体系的立枯丝核菌来说，该技术为其引起的病害的田间防控提供了一种新的手段。
3、dsrna虽不像单链rna那样极易被降解，但病原菌体内外的大量rna酶还是容易使dsrna失活。纳米材料因其小尺寸效应、界面效应和高渗透效应，可以改善药效成分的稳定性，促进对靶沉积与剂量的转移，减少流失，提高利用率。将dsrna装载至纳米材料，通过其高渗透性将更多量的dsrna运输至植物体内，从而提高外源dsrna对病原菌靶基因的干涉效应，减轻其危害，可大大提高dsrna对植物病害的防控效果。
4、本发明以立枯丝核菌为对象，选择对病菌致病功能有影响的多聚半乳糖醛酸酶基因 rspg1、过氧化氢酶基因 rscat和钙调神经磷酸酶响应锌指蛋白基因 rscrz1为靶标，通过体外合成靶向3个基因的组合 rspcc-dsrna，并将 rspcc-dsrna装载于可增加递送效率的双层氢氧化物纳米材料ldh后，喷施于植物叶片表面，可有效降低病菌中靶基因的表达水平、病菌在作物叶片中的积累量，以及植物叶片上的病斑面积，说明利用靶基因组合dsrna可很好控制立枯丝核菌病害的发生。
5、
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决上述问题，研发一种新型纳米农药，针对植物病害防治化学药剂使用量大、次数多、容易引起抗药性和农药残留问题，应减少化学药剂的使用，增强生物防治措施，具体为一种防治立枯丝核菌病害的dsrna纳米农药的制备及其应用。
2、本发明的目的是这样实现的：
3、一种防治立枯丝核菌病害的dsrna纳米农药的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
4、步骤1）：通过体外转录合成靶向立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因 rspg1、过氧化氢酶基因 rscat和钙调神经磷酸酶敏感的锌指蛋白基因 rscrz13个基因的组合 rspg1- rscat-rscrz1-dsrna，简称 rspcc-dsrna片段，设带有同源臂的引物将 rspg1、 rscat、 rscrz1三个基因串联起来；其中：
5、 rscat-dsf 引物序列为 ：acagcatctcgaaccgacactgctcgcgaccc;
6、 rscat-dsr 引物序列为 ：tccgacagaacgagcccacttaaaggtatgtccagagt;
7、 rspg1-dsf 引物序列为 ：acgggggacgagctccgggaaagggtatcacattcaa;
8、 rspg1-dsr 引物序列为 ：gtcgcgagcagtgtcggttcgagatgctgtaggtatg;
9、 rscrz1-dsf引物序列为 ：catacctttaagtgggctcgttctgtcggagatg;
10、 rscrz1-dsr引物序列为 ：ccatgtcgactctagctcatgtcgcttgcagtcat;
11、步骤2）：利用引物对 rspg1-dst7f/ rscrz1-dsr和引物对 rspg1-dsf/ rscrz1-dst7r分别扩增出正义链5’-端带t7启动子和反义链5’-带t7启动子的模板，并回收纯化；其中:
12、 rspg1-dst7f引物序列为: taatacgactcactatagggcgggaaagggtatcacattcaa;
13、 rscrz1-dsr引物序列为: tcataccacaactccaccg；
14、 rspg1-dsf引物序列为: cgggaaagggtatcacattcaa；
15、 rscrz1-dst7r引物序列为: taatacgactcactatagggctcatgtcgcttgcagtcat；
16、步骤3）：根据诺唯赞t7 rnai transcription kit说明书进行体外转录，后纯化,即 rspcc-dsrna。将 rspcc-dsrna与ldh纳米材料共孵育，将体外转录约1043 bp的 rspcc-dsrna与ldh按不同质量比共孵育不同时间，用1%凝胶电泳评估dsrna被负载情况，结果显示当dsrna：ldh的质量比为1:2孵育2 h后，ldh可完全负载不同长度的dsrna。
17、步骤3）中，dsrna纳米农药保存在-80℃冰箱备用。
18、一种防治立枯丝核菌病害的dsrna纳米农药的在防治立枯丝核菌病害上的应用。应用方法为：将合成的 rspcc-dsrna稀释后喷施水稻叶片表面。具体为： rspcc-dsrna稀释到50 μg/μl后喷施水稻叶片表面。
19、本发明方法先进科学，通过本发明，一种防治立枯丝核菌病害的dsrna纳米农药的制备包括：
20、步骤1：通过体外转录合成靶向立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因 rspg1、过氧化氢酶基因 rscat和钙调神经磷酸酶敏感的锌指蛋白基因 rscrz13个基因的组合 rspg1- rscat-rscrz1-dsrna（简称 rspcc-dsrna片段），设带有同源臂的引物将 rspg1、 rscat、 rscrz1三个基因串联起来。
21、步骤2：然后利用引物对 rspg1-dst7f/ rscrz1-dsr和 rspg1-dsf/ rscrz1-dst7r分别扩增出正义链5’-端带t7启动子和反义链5’-带t7启动子的模板，并回收纯化。
22、步骤3：根据诺唯赞t7 rnai transcription kit说明书进行体外转录。最后纯化后保存在-80℃冰箱备用。
23、利用引物对 egfp-t7f/ egfp-r和 egfp-f/ egfp-t7r分别扩增出 egfp的正义链5’-端带t7启动子和反义链5’-端带t7启动子的片段，扩增产物电泳后回收纯化，作转录合成 egfp-dsrna的模板。用诺唯赞t7 rnai transcription kit体外转录出 egfp-dsrna，用roche fluorescein rna labeling mix体外转录出带荧光素标记的 egfp-dsrna。通过电泳检测显示转录产物量均较高，约500 ng/μl，将其稀释到50 ng/μl。将合成的带有荧光素标记的50 ng/μl egfp-dsrna与新鲜的立枯丝核菌菌丝共孵育24 h后，用激光共聚焦显微镜观察荧光信号，与对照相比，荧光素标记 egfp-dsrna处理完的立枯丝核菌菌丝可观察到强烈的荧光信号。将观察到荧光的立枯丝核菌菌丝用mnase处理，去除表面可能的残余 egfp-dsrna后制备成原生质体，在立枯丝核菌原生质体内可清晰地观察到荧光信号，说明立枯丝核菌可以摄取外源dsrna。
24、通过体外转录合成靶向立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因 rspg1、过氧化氢酶基因 rscat和钙调神经磷酸酶敏感的锌指蛋白基因 rscrz13个基因的组合 rspg1-rscat- rscrz1-dsrna（简称 rspcc-dsrna片段），将其与立枯丝核菌共孵育，结果显示其处理后，立枯丝核菌菌落形态、菌丝重量等与对照无显著差异。收集菌丝，提取立枯丝核菌总rna，以立枯丝核菌 gapdh基因为内参进行qrt-pcr。qrt-pcr结果也显示经 rspcc-dsrna处理后，靶标基因的转录水平均下调。
25、将体外转录的约200 bp的 egfp-dsrna与ldh按不同质量比共同孵育不同时间后，用1％凝胶电泳评估dsrna被负载情况，结果显示当dsrna：ldh的质量比为1:16时，共孵育时间为2 h时，2倍质量的ldh可负载所有dsrna。表明ldh可有效负载dsrna。同样将 rspcc-dsrna与ldh进行共孵育，将体外转录约1043 bp的 rspcc-dsrna与ldh按不同质量比共孵育不同时间，用1%凝胶电泳评估dsrna被负载情况，结果显示当dsrna：ldh的质量比为1:2孵育2 h后，ldh也可完全负载不同长度的dsrna。
26、在本氏烟叶片上喷施 egfp-dsrna-ldh，以 egfp-dsrna为对照，24h后用水冲洗并进行荧光观察，发现对照的叶片表面游离dsrna含量高，易被冲洗，而喷施 egfp-dsrna-ldh冲洗前后对比荧光消失较少，说明ldh负载的dsrna耐冲洗，ldh可各高效的将dsrna运输至叶片体内。
27、将合成的 rspcc-dsrna稀释至50 μg/μl，喷施水稻叶片表面，后接种立枯丝核菌，观察发现喷施 rspcc-dsrna的植株上立枯丝核菌引起的症状明显减轻，病斑面积为对照31.6%，且寄主病组织中菌丝量和菌株靶基因的表达量均有明显下调。
28、本发明优点及效果：sigs因不需要转基因，解决了许多植物不能进行遗传操作的难题，且dsrna来源于病原菌本身，不会在土壤和环境中留下有毒残留物而对环境造成污染，从而具有更广阔的应用前景。虽然目前世界各国对dsrna产品的应用与管理还未有共识，但包括欧洲科学界在内各国科学家和相关组织已开始评估此类产品的监管框架，基于dsrna农药将很快在生产上被广泛应用。