生防菌对两种作物病害的防治作用及机理
摘要：
生防放线菌对植物土传病害的防效虽有一定研究,但放线菌对植物叶片病毒病是否有防治作用尚不清楚,且医用灰黄靑霉对农作物生物防治研究很少.本文以附子土传根系病害和番茄叶片病毒病害为对象,研究了供试放线菌的抗病作用,附子土传根系病害的发生机制,灰黄靑霉对齐整小核菌的抗病作用及放线菌对两类病原不同农作物病害的防病作用与机制,发现放线菌除对植物病原具有直接抗病作用外,还能激活植物系统抗性,对植物病毒病害也有一定防效.论文主要内容及研究结果如下: 1.生防菌的抗病作用研究.采用平皿培养及显微镜观察法分别研究了5株拮抗放线菌无细胞发酵滤液对齐整小核菌菌丝生长,菌核形成与萌发的抑制效应及其对病原菌丝的溶解作用;采用平皿模拟试验研究了黄三素链霉菌和濑里予链霉菌活菌制剂对土壤中齐整小核菌菌核活性的影响.结果表明:5株放线菌无细胞发酵液对齐整小核菌菌丝生长,菌核形成及菌核萌发均有较强抑制作用.在培养48h时,黄三素链霉菌5倍稀释发酵液对病原菌菌丝的抑制率达52.8%;对菌核形成抑制率达99.5%;在培养96h时,对菌核萌发的抑制率为100%.濑里予链霉菌稀释103发酵液对浸泡菌核上新生菌丝生长的抑制率达90.3%.黄三素链霉菌和濑里予链霉菌活菌制剂可抑制土壤中菌核萌发并促进土壤中菌核腐烂,濑里予链霉菌用量为1g/kg土时,可使土壤中68.0%的菌核失去萌发能力,48.0%的菌核腐烂.以齐整小核菌菌体为唯一碳源可诱导供试链霉菌合成几丁质酶,β-1,3-葡聚糖酶及纤维素酶,黄三素链霉菌可同时产生3种胞壁水解酶,在培养5d时,其粗酶液的3种胞壁水解酶活性分别达4.3U,4.6U及2.4U,黄三素链霉菌和密旋链霉菌粗酶液对供试病原菌细胞壁有溶解作用.上述结果显示,供试放线菌对齐整小核菌菌丝及菌核均有显著抑制效果,濑里予链霉菌活菌制剂具有很大的生防潜力. 2.附子土传根系病害的发生机制研究.通过稀释平皿培养法比较同一田块中附子白绢病病株与健株根际可培养土壤微生物区系,并对其中的优势微生物进行分子生物学鉴定,同步测定优势微生物代谢产物的抗病作用与促生活性,获得了根区优势微生物控制植物生长的直接证据.结果表明,附子白绢病病株与健株根区,根表土壤,根内微生物数量及种类有显著差异.病株根区,根表土壤中可培养细菌,真菌之比较健株降低,而健株根区,根表及根内放线菌数量显著高于病株.在病株根区,根表土壤及根内的优势微生物中,部分为致病菌或有害菌,其中,有些菌株的发酵液对病原菌齐整小核菌生长有促进作用,对甜瓜生长有抑制作用.在附子健株根区,根表土壤及根内生长的所有优势微生物,均分泌抑制齐整小核菌菌丝生长的抗菌活性物质,且部分健株优势菌对甜瓜种子有促生作用.结论:附子根区,根表土壤及根内优势微生物是附子健康生长或白绢病发生的控制者,决定着附子的"命运",齐整小核菌并不是引起附子白绢病的唯一病原. 3.生防放线菌的直接抗病作用.通过3年定位试验研究了向土壤中施用密旋链霉菌Act12和娄彻氏链霉菌D74活菌制剂对附子的防病促生作用,并对停止施用菌剂的后续效果进行了跟踪观察,采用高通量测序及可培养方法同步研究了定位试验第2年时菌剂对附子根际土壤中的微生物群落结构的影响,并通过生长速率法,培养皿对峙试验及GFP标记技术研究了供试放线菌的生防特性.结果表明,向附子根系分布区土壤中施入Act12和D74孢子粉组成的混合菌剂,根系土传病害病情指数显著降低75.5%~77.0%(P<0.05),经济器官块根产量显著提高62.1%~74.1%(P<0.05),根际土壤养分残留减少.该菌剂能显著增加根际土壤中有益菌数量,减少有害菌数量.该菌剂引起的根际土壤微生态效应可产生良好的后效,在两季均施用菌剂的处理中,下茬作物根系土传病害病情指数显著降低20.7%(P<0.05),产量显著提高20.6%(P<0.05).该菌剂的发酵液可显著抑制附子土传病原菌齐整小核菌及腐皮镰刀菌菌丝生长,对腐皮镰刀菌菌丝有溶解及缢缩作用,且D74能在附子根表定殖. 4.灰黄青霉CF3的抗病促生作用及齐整小核菌菌核控制基因研究.采用平皿试验测定了灰黄青霉CF3对两株病原真菌菌丝生长,对齐整小核菌菌核形成与萌发及对附子根际可培养微生物的影响;通过田间小区试验研究了CF3活菌制剂对附子根腐病及白绢病的防效;利用生物信息学,分子生物学及菌核形成试验相结合的方法对齐整小核菌菌核形成控制(相关)基因进行了探索研究.结果表明:CF3可显著抑制齐整小核菌及尖孢镰刀菌菌丝生长,并抑制齐整小核菌菌核形成与萌发;CF3可在附子根际土壤中大量定殖,可显著增加附子根际土壤中有益菌B.toyonensis,L.fusiformis和P.javanicum数量,减少有害菌X.translucens和F.oxysporum的数量,使土传根系病害病情指数较对照显著降低29.8%,附子块根质量显著提高81.5%(P<0.05);初步锁定了控制齐整小核菌菌核形成的3个基因为ArsclR,ArnsdD1及ArnsdD2,并从基因水平揭示了CF3无细胞发酵滤液抑制齐整小核菌菌核形成的机制. 5.供试放线菌对番茄TYLCVD的防效及对番茄系统抗性的激活作用研究.通过小区及苗期试验研究了Act12对TYLCVD的防病促生效果及其机理,并通过后续2茬小区试验对Act12对TYLCVD的防效进行验证.研究内容包括番茄叶片病毒含量,抗性相关酶活性,内源激素含量,系统抗性及RNAi相关基因相对表达量等指标,并对根区,根表土壤微生物区系进行了高通量测序.田间小区试验表明,向土壤中穴施放线菌Act12活菌剂:①小区番茄的TYLCD发病率及病情指数较对照分别降低26.0%~37.9%及20.0%~44.3%(P<0.05),番茄果实质量提高7.2%~175.3%(P<0.05).②可提高番茄根际土壤细菌多样性,增加番茄根际有益菌的丰度;使根际土壤微生物群落分化,有序性显著提高,微生物分子生态网络中,微生物群落呈现多模块分化现象.向育苗基质中接种Act12活菌剂:①可显著提高番茄叶片中POD,PPO,PAL等抗性相关酶活性,减少活性氧在叶片中积累量,提高叶片中SA和JA含量.②可激活番茄系统抗性.其中,获得抗性(SAR)和诱导系统抗性(ISR)通路相关基因PR-1和SIPI-Ⅱ,番茄特异性抗TYLCD相关基因SIPer1和SIVRSLip,以及RNAi相关基因表达均显著上调.上述结果表明,供试放线菌具有激活番茄系统抗性,提高番茄抗卷叶黄化病病毒病的功能.