GPCR的表达、纯化和稳定性研究
GPCR的表达、纯化和稳定性研究
2021-01-18 18:12
近年来，产后康复13825404095GPCRs表达、纯化和稳定性优化技术的发展使得GPCR的结构研究取得了重大突破。传统的蛋白质晶体学研究需要大量高纯度的，具有同质性的蛋白质样品，以形成有序的晶体。本文对现有的和成熟的GPCR表达、纯化和稳定性方法进行介绍。
（图片来源于《Status of GPCR Modeling and Docking as Reflected by Community-wide GPCR Dock 2010 Assessment》）
GPCR的表达方法
由于GPCR在天然组织、器官的细胞表面丰度较低，因此近年来科学家们已经评估了许多表达策略来提高GPCR的表达水平。目前，被应用于生产大量GPCR蛋白的方法，包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等表达系统。
GPCR像许多其他真核蛋白质一样，在翻译后需要经过大量修饰（修饰包括糖基化，脂肪酰化（通常为棕榈酰化）和磷酸化）才能正确折叠、运输。然而，以往被认为成本低，经济实惠的大肠杆菌表达系统由于缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统，因此，很少用来表达GPCR蛋白。此外，研究发现该系统还常常导致包涵体的形成，使得生产正确折叠的蛋白质变得困难。
酵母表达系统是一种有吸引力的表达系统，其具有通过真核机制修饰受体的功能。但是，酵母细胞膜周围存在细胞壁和缺乏合适的膜脂，这使得从酵母细胞膜中提取高度均一的GPCR具有挑战性。
杆状病毒-昆虫细胞表达系统是GPCR结构研究的最成功的表达系统，它为GPCR提供了比细菌和酵母更天然的膜环境，并具有适当的翻译后修饰功能。
哺乳动物细胞表达系统则是最佳的表达系统，具有完整的翻译后修饰功能和最完美的生理环境。对于某些受体，某些罕见的修饰（如酪氨酸硫酸化）在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中很难实现表达，然而，这些受体的稳定性和功能又至关重要，此时，就可以使用哺乳动物细胞表达系统对该类受体进行表达，以进行结构和功能研究。
GPCR的纯化方法
蛋白在获得充分表达后，下一步的关键工作是对蛋白进行提纯，旨在获得大量均一、纯度高的GPCR蛋白样品。在这个过程中我们需要选择合适的去污剂，该去污剂一方面需要使蛋白从细胞膜上洗涤下来，另一方面需要使溶液中的蛋白保持结构和功能特性。去污剂疏水性和亲水性之间的平衡对溶解GPCR和使GPCR保持正常的生物特性至关重要。有研究发现，与长烷基链洗涤剂相比，短烷基链去污剂形成更小的胶束，可提供更多的晶体接触机会，但在增溶和提纯过程中对GPCR的要求更为严苛。GPCR结构研究中广泛使用的洗涤剂有十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)、ｎ-癸基-α-D-麦芽糖苷(DM)、月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)和 洋地黄皂苷。
另外人们普遍认为，膜蛋白在从天然脂质环境中提取时应该保持其结构的完整性。过去研究发现脂质和胆固醇在保持GPCR的正常功能中具有关键作用，已证明将去污剂与脂质结合使用可用于GPCR结构确定。因此，人们将脂质胆固醇半琥珀酸酯（CHS）广泛添加到各种去污剂中，为蛋白创造更天然的脂质环境。初期，为了从细胞膜中提取蛋白，去污剂的浓度需要维持在较高水平，以超过临界胶束浓度（CMC），防止细胞膜形成蛋白质－去污胶束。溶解步骤之后，在纯化过程中去污剂的浓度需要逐步降低，以最大程度地减少蛋白质的聚集和变性。不同的GPCR的最佳去污剂种类和浓度差别较大。科学家发现，有时一种高效增溶GPCR的去污剂并不是维持其稳定性和功能的最佳选择。因此，在GPCR蛋白纯化过程中选择去污剂需十分谨慎。
GPCR的稳定性研究
GPCR在细胞膜中起着重要的信号转导作用，其通过柔性区域和跨膜螺旋的重排而显示多种构象。然而，GPCR的结构研究往往需要单一构象的，高度均一的样品。目前可以通过添加配体来实现，将受体稳定于一个特定的构象状态。配体的作用范围，包括从促进特定反应的激动剂，到竞争性占据配体结合位点而不改变受体基础活性的拮抗剂，再到降低受体基础活性的反向激动剂等。研究发现筛选合适的配体将GPCRs锁定在特定构象中，可以提高GPCR的稳定性和同源性，并且能显著增加GPCR结构确定的可能性。
来源于人工合成的噬菌体展示文库和强大的体外筛选的抗体和纳米抗体也被成功地用于解决GPCR结构。最初，为了提高GPCR构象稳定性和增加晶体堆积的极性表面积，科学家曾使用单克隆Fab来结晶b2AR。纳米抗体（Nb）是骆驼科动物（如骆驼和驼科动物）产生的重链可变片段，分子量小。纳米体在捕获单一状态的GPCR方面表现出很高的结合亲和力。在活性B2AR的晶体结构中，Nb35选择性地识别和锁定B2AR的活性构象，极大地稳定了结晶学上的受体-G蛋白复合物。随着GPCR结构测定技术的进步，抗体已成为稳定GPCRs构象和组装稳定复合物用于结晶和冷冻电镜实验的通用工具。
制备热稳定性受体涉及多种蛋白质工程方法，包括降低分子柔性的柔性环的截断和缺失，增加热稳定性的稳定点突变的引入等。目前，最成功的方法是用稳定、致密、易结晶的融合蛋白结构域取代受体的柔性片段，这一方法既可以降低了环区柔性，又可以增加晶格接触所需的极性表面积。科学家在应用T4溶菌酶融合蛋白后，从蛋白质数据库(PDB)中又筛选到另外5个融合蛋白，包括T4溶菌酶的C端片段、黄素氧还蛋白、木聚糖酶、红素氧还蛋白和载脂细胞色素b562，它们已被证明能够改善GPCR的表达、稳定性和晶体堆积。
GPCR中的柔性区域会降低蛋白质同质性。在虚拟二级结构预测软件和数据库的帮助下，可以准确地预测受体中固有的无序区域（这些区域没有稳定的构象），如N末端、细胞内环和C末端。一般来说，无论截短如何，所解析的GPCR结构中的N末端或C末端长度均小于40个残基。对于具有大N末端的B1，B2，C和F类家族的受体，N末端经常被截短以促进TMD的结晶。否则，它们需要通过配体或抗体稳定以解决全长受体结构。
此外，GPCR蛋白质量优化的有效方法涉及系统的诱变策略。GPCR的诱变被广泛用于改善蛋白质表达和稳定性。为了寻找构象选择点突变，已经进行了系统的丙氨酸扫描诱变，其中每个残基被丙氨酸或亮氨酸（如果最初是丙氨酸）取代。该策略有助于鉴定火鸡b1AR中的六个突变，这些突变显着提高了其热稳定性。一些突变源自不同基因之间的序列比对。根据序列差异和视紫红质结构，在人b2AR中引入热稳定突变E1223.41W以改善TM3，TM4和TM5之间的相互作用。该突变推动了b2AR与反向激动剂，拮抗剂结合的复合物的结构测定，并且还被用于解析一些其他A类GPCR的结构，例如趋化因子受体CXCR4和D3多巴胺受体（DRD3）。
纳米圆盘技术在GPCR研究中的应用
纳米圆盘（Nanodiscs）是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。通过这种特殊的结构，GPCR可以整合到Nanodiscs中，保持其生物学活性，为GPCR的研究提供了有力的技术支持。膜支架蛋白(MSPs)是载脂蛋白(apo) A-I的缩减版，它们包绕着脂质双分子层从而形成圆盘状的结构，即纳米盘。其包含一个朝向内部脂层的疏水面和朝外的亲水面。这一结构使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同时具有非常高的稳定性。通过Nanodisc包裹，纯化后的GPCR在保持空间结构稳定和活性的同时，也将不期望暴露的跨膜域如同在细胞膜内一样包埋在磷脂双分子层内部。
公司拥有1300平方米的研发实验室和一流的仪器设备，实验室配备有分子克隆室、蛋白质表达纯化平台，拥有不同的蛋白表达系统，可生产大量优质GPCR抗原。我们还开发了成熟的纳米圆盘技术（Nanodiscs）对纯化后GPCR进行组装，助力GPCR药物开发。
核心团队由海外高层次人才专家，哈佛大学、中科院上海药物研究所等多所顶尖科研院所博士组成，在膜蛋白药物研发等领域具有丰富经验，掌握脂质立方相(LCP)结晶、X射线自由电子激光和冷冻电镜技术，可以解析重要药物靶点结构。目前已经解析了数百种药物靶点结构，其中包括数十个离子通道蛋白、GPCR和PARPs家族的结构。
参考文献：Qu X , Wang D , Wu B . Progress in GPCR structure determination[J]. GPCRs, 2020.返回搜狐，查看更多
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